ENO1相关基因标志物预测弥漫性大B细胞淋巴瘤预后及治疗反应

《Frontiers in Immunology》：ENO1-related gene signature predicts prognosis and therapeutic response in diffuse large B-cell lymphoma

本研究通过多组学整合分析（RIP-seq、RNA-seq、蛋白互作组）鉴定ENO1相关基因（ERG），并利用机器学习构建了包含11个枢纽基因（CHERP、SYNE2、INTS1、FAP、MMP9、LRP5、RBM8A、PRMT5、SLC25A6、PABPC4、PSTPIP2）的预后模型。该ERG评分系统能有效预测DLBCL患者生存，识别免疫抑制性肿瘤微环境（TIME），并指导化疗药物（如长春新碱、依托泊苷、奥沙利铂）敏感性。实验验证表明关键基因PABPC4可促进DLBCL增殖，为精准治疗提供新靶点。

　　

引言

弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中最常见的亚型，约占病例的30-50%。DLBCL具有高度侵袭性，根据细胞起源可分为生发中心B细胞样（GCB）和活化B细胞样（ABC）亚型，其中ABC亚型预后较差。标准R-CHOP方案（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松）治疗后，仍有40-50%患者出现耐药或复发，凸显了对可靠预后生物标志物的迫切需求。

α-烯醇酶（ENO1）是一种多功能蛋白，不仅催化糖酵解步骤（将2-磷酸-D-甘油酸转化为磷酸烯醇丙酮酸），还作为RNA结合蛋白稳定致癌mRNA（如YAP和IRP1），并通过与免疫相关分子相互作用调节免疫反应，可能促进肿瘤免疫逃逸。然而，ENO1相关基因（ERG）的整体景观及其对DLBCL预后的集体影响尚不清楚。

材料与方法

本研究整合了RNA测序（RNA-seq）、RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）和蛋白质相互作用谱（蛋白互作质谱分析，IP-MS）数据，以鉴定ERG并探索其在DLBCL中的功能。流程图概述了研究设计。

通过ENO1敲低（shENO1）的Burkitt淋巴瘤Daudi细胞进行RNA-seq，鉴定出82个差异表达基因（DEGs）。在Daudi细胞中进行RIP-seq，结合三种峰值识别方法（Piranha、CIMS、ABLife专利算法），一致鉴定出32个高置信度ENO1结合RNA靶标。在Raj i细胞中进行IP-MS，鉴定出345个ENO1相互作用蛋白（≥4倍富集）。总计获得459个ERG。

功能富集分析（GO和KEGG）使用R包“clusterProfiler”进行。从GEO数据库获取DLBCL患者的RNA-seq数据和临床信息，训练集为GSE10846（n=412），验证集为GSE181063（n=1,144）和GSE87371（n=221）。使用“ConsensusClusterPlus”包基于ERG表达对患者进行共识聚类分析。

预后模型的构建采用单变量Cox回归和最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归分析，最终通过多变量Cox回归得到11基因特征。风险评分计算公式为：ERG score = ∑ (Expi × coefi)，其中Expi为基因表达量，coefi为系数。患者根据中位风险评分分为高危组和低危组。通过主成分分析（PCA）、Kaplan-Meier（KM）生存分析和时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线评估模型性能。

肿瘤免疫微环境（TIME）分析使用CIBERSORT和xCell算法计算免疫细胞浸润比例，并使用ESTIMATE算法计算免疫评分、基质评分和估计评分。药物敏感性预测使用R包“oncoPredict”，基于癌症药物敏感性基因组学（GDSC）数据库计算半数抑制浓度（IC₅₀）。

通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测6个DLBCL细胞系中11个预后基因的表达水平，并计算ERG风险评分。使用CRISPR-Cas9系统构建PABPC4稳定敲低细胞系（SU-DHL4和Daudi）。通过细胞增殖实验（CCK-8法）和集落形成实验评估细胞活力。在BALB/c裸鼠中进行皮下成瘤实验以验证PABPC4的体内功能。

结果

ERG鉴定、分子聚类与预后模型构建

整合分析共鉴定出459个ERG。GO和KEGG富集分析显示这些基因显著富集于RNA剪接、翻译起始和mRNA代谢过程等功能。

基于GSE10846数据集的共识聚类分析将414名DLBCL患者分为两个簇（Cluster 1: n=180; Cluster 2: n=234）。生存分析显示Cluster 1患者的总生存期（OS）显著差于Cluster 2。临床特征热图显示Cluster 2与结外病灶数量显著相关。

通过单变量Cox回归鉴定出39个与预后相关的ERG。LASSO和多变量Cox分析最终得到一个包含11个基因的预后特征：保护基因（CHERP、SYNE2、INTS1、FAP、MMP9；风险比HR<1）和风险基因（LRP5、RBM8A、PRMT5、SLC25A6、PABPC4、PSTPIP2；HR>1）。网络分析（GeneMANIA）显示这些基因之间存在显著的共表达和遗传相互作用，功能注释涉及mRNA剪接、RNA 3‘-末端加工和凝血通路。亚群富集分析揭示了功能收敛：RNA结合模块（ENO1、RBM8A、PABPC4、CHERP）富集于RNA稳定性/降解和mRNA监视通路；蛋白酶模块（FAP、MMP9）参与内肽酶活性，与细胞外基质重塑和转移相关。

在训练集GSE10846中，根据ERG评分将患者分为高危组和低危组。PCA显示两组患者能明显区分。KM曲线表明高危组患者OS显著更差。时间依赖性ROC曲线分析显示，模型预测1年、3年和5年OS的曲线下面积（AUC）分别为0.753、0.777和0.772，表明模型具有良好的预测性能。该模型在两个独立验证集（GSE181063和GSE87371）中也得到了有效验证。

ERG评分与临床特征及免疫微环境的关联

ERG风险评分与多种不良临床特征显著相关，包括年龄>60岁、ABC亚型、ECOG评分>2、血清乳酸脱氢酶（LDH）水平高于正常值、临床分期晚和转移状态，但与性别无关。多变量Cox回归分析证实ERG评分是DLBCL患者OS的独立预后因素。基于ERG评分和临床特征构建的列线图具有良好的校准能力。

免疫景观分析揭示高危组患者具有免疫抑制性TIME特征：CIBERSORT算法显示，与低危组相比，高危组中具有先天抗肿瘤活性的γδ T细胞和M0巨噬细胞水平显著降低，而具有免疫抑制作用的M2巨噬细胞水平显著升高。xCell算法进一步证实高危组CD8⁺ T细胞显著减少，同时活化树突状细胞（aDCs）、记忆B细胞、NKT细胞和Th1细胞增加。然而，在细胞毒性效应细胞（γδ T细胞、CD8⁺ T细胞）显著缺失和免疫抑制性M2巨噬细胞占主导的背景下，Th1/NKT细胞的增加可能不足以逆转整体的免疫抑制状态。ESTIMATE算法结果显示，高危组的ESTIMATE评分、基质评分和微环境评分均显著低于低危组，提示其总体免疫细胞浸润和基质成分减少。

此外，高危组免疫检查点分子表达显著失调：与免疫激活和共刺激相关的基因（如B2M、CD28、CD40LG、ICOS、CD86、IL23A、LDHA）显著下调，可能损害T细胞活化、抗原呈递和效应功能；而与免疫抑制或耗竭相关的基因（如LGALS9、TNFSF9、YTHDF1、PVR）显著上调。这些免疫检查点分子的表达变化与患者预后不良相关。

ERG评分预测治疗反应及PABPC4功能验证

药物敏感性分析预测高危组患者对长春新碱、依托泊苷和铂类药物（如奥沙利铂）更敏感。在6个DLBCL细胞系中的实验验证证实，根据ERG评分划分的高危组细胞（OCI-LY1、OCI-LY3、DB）对长春新碱和奥沙利铂的IC₅₀值显著低于低危组细胞（OCI-LY7、U2932、SU-DHL4），即敏感性更高。对表柔比星的敏感性差异虽未达统计学显著性，但高危组细胞的IC₅₀值也倾向于更低。

在ERG评分系统中，PABPC4的系数贡献最大。生物信息学分析显示PABPC4在DLBCL中显著高表达，且其高表达与患者OS较差相关。通过CRISPR-Cas9系统成功构建了PABPC4敲低的SU-DHL4和Daudi细胞系。体外实验表明，敲低PABPC4显著抑制了细胞增殖能力和集落形成能力。体内小鼠皮下成瘤实验进一步证实，敲低PABPC4可显著延迟肿瘤生长，降低肿瘤体积和重量，且肿瘤组织中的Ki67增殖指数显著降低，而对小鼠体重无显著影响。这些结果首次证明PABPC4在体外和体内均能促进DLBCL细胞的增殖。

讨论与结论

本研究成功构建并验证了一个基于11个ERG的预后评分系统，该模型能有效预测DLBCL患者的生存结局，并作为一个独立的预后因素。模型与已知的不良临床特征（如高龄、ABC亚型、晚期、高LDH）的一致性，强化了其生物学相关性和临床应用潜力。

更重要的是，该模型揭示了DLBCL进展的关键机制，即通过重编程肿瘤微环境（TME）诱导免疫抑制状态。高危患者表现出深刻的免疫抑制性重塑，包括促肿瘤的M2巨噬细胞富集、关键抗肿瘤效应细胞（如CD8⁺ T细胞、γδ T细胞）的耗竭，以及免疫检查点分子的失调（如LAG3上调，B2M、CD28下调）。这些改变共同营造了一个免疫耐受的微环境，为高危患者预后差提供了机制解释，并提示了免疫治疗的潜在靶点。

该模型预测治疗反应的能力是其重要的转化医学价值。研究发现高危患者对长春新碱、表柔比星和奥沙利铂更敏感，并在细胞系中得到验证，这有助于为侵袭性DLBCL亚群合理选择化疗药物。此外，ERG评分与免疫检查点表达的关联支持了联合治疗策略的探索。

本研究首次在功能上证实了PABPC4在促进DLBCL增殖中的关键作用。PABPC4作为一种RNA处理蛋白，通过增强翻译和mRNA稳定性来促进基因表达。初步实验验证了ENO1与PABPC4之间存在相互作用，但其在DLBCL中具体的RNA稳定机制有待进一步阐明。

研究的局限性包括ERG特征源自与DLBCL遗传背景不同的Burkitt淋巴瘤细胞模型，但其在DLBCL队列中的稳健预后性能表明其捕捉了侵袭性B细胞淋巴瘤共有的基本生物学过程。此外，实验验证并未区分模型基因与ENO1的相互作用是直接的物理相互作用还是间接的功能关系。

总之，本研究开发的ERG评分模型不仅能预测DLBCL患者的预后，还能指导治疗决策。同时，首次通过体内外实验验证了PABPC4促进DLBCL进展的功能，为理解DLBCL的发展机制提供了新的视角，并为精准治疗提供了新的潜在靶点。