Tergitol在肝脏脱细胞化及细胞外基质生物墨水制备中的创新应用研究

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Application of tergitol in liver decellularization and bioink preparation based on the obtained extracellular matrix

本研究首次将非离子表面活性剂Tergitol 15-S-9创新性应用于猪肝脏脱细胞化，开发了高效检测基质残留Tergitol的HPLC-CAD方法，并成功构建了基于脱细胞细胞外基质（dECM）的复合生物墨水。研究通过系统比较13种脱细胞方案，证实Tergitol梯度联合胰蛋白酶预处理的方案能显著降低DNA（<50 ng/mg）和脂肪含量（1.46%），较好保留胶原蛋白（10倍富集），且生物墨水具有优良的流变特性（G' 5–38.5 Pa）和3D打印适应性（打印性>80%），为肝脏组织工程提供了新型生物材料解决方案。

　　

引言

肝脏疾病每年导致全球约200万人死亡，肝硬化和肝癌分别位列死因第11和第16位。肝移植虽是终末期肝病的有效疗法，但全球器官短缺导致20%患者在等待中死亡。组织工程生物材料为肝脏再生提供了新策略，其中脱细胞器官支架能保留天然细胞外基质（ECM）结构，成为构建3D组织模型的关键。ECM作为组织中的非细胞成分，在健康肝脏中占比<3%，包含105种蛋白质构成的复杂网络，具有物理支撑和信号调控双重功能。

材料与方法

研究采用屠宰场获取的猪肝脏，通过13种差异化脱细胞方案（涉及SDS、脱氧胆酸钠、Triton X-100、Tergitol 15-S-9等去污剂与胰蛋白酶、DNase酶组合），在4°C下进行12天梯度处理。通过DNA含量、残留脂质、硫酸化糖胺聚糖（sGAG）、胶原蛋白及去污剂残留等指标评估脱细胞效果。创新建立HPLC-CAD法检测Tergitol残留（线性范围0.3–200 μg/mL，R²=1.0，定量限5 ng/mg）。基于最优dECM制备7种水凝胶（酶解条件：ficin 60°C/3h、pepsin 0.1M HCl/48h、胶原酶37°C/15min），并通过流变学测试（粘度223 mPa·s，相变温度18.8–19.25°C）和3D打印评估（21G/25G针头，UV交联15s）生物墨水性能。

结果

脱细胞后组织由红粉色转为白色（图2）。Tergitol梯度+胰蛋白酶方案（Protocol 12）表现最优：DNA残留降至13.73 ng/mg（降幅>99%），脂肪含量最低（1.46%），电泳未见DNA条带（图4）。sGAG保留量较低（0.51 μg/mg），但DNA标准化后显示Tergitol方案sGAG/DNA比值最高（图6B）。胶原蛋白富集达10倍（664.12 μg/mg），显著高于天然组织（图7）。残留去污剂检测显示Tergitol与Triton X-100均<1 μg/mg，而SDS残留达5.96 μg/mg（表3）。水凝胶提取物对L-929细胞毒性测试显示存活率>70%（图8）。生物墨水打印性优异，孔隙≥4 mm²时打印性>80%，纤维连续性良好（图10）。

讨论

非离子去污剂Tergitol在保留ECM结构方面优于离子型SDS，其降解产物环境毒性较低。研究首次验证HPLC-CAD检测Tergitol残留的可行性，为生物材料安全性评估提供新工具。sGAG损失可能通过外源性补充补偿，而胶原蛋白的保留对肝细胞功能（如HGF信号调控）至关重要。脂肪残留可能影响生物墨水流变性，γ辐射灭菌时需注意脂质过氧化风险。研究局限性包括未评估物种特异性抗原（如α-gal）及长期细胞功能，未来需结合人源细胞验证肝脏特异性标志物（白蛋白、CYP450）表达。

结论

Tergitol为肝脏脱细胞化提供了安全有效的替代方案，所构建的dECM生物墨水具备优良打印性和生物相容性，为药物筛选、毒性测试及肝脏组织模型构建提供了新的技术路径。