高粱k1C卡非林家族大规模缺失与再平衡研究：CRISPR/Cas9编辑对营养品质与蛋白体形态的影响

《Frontiers in Plant Science》：Large scale deletion and rebalancing within the k1C kafirin family in sorghum

本综述系统探讨了利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑高粱高度重复的α-卡非林基因家族（k1C）的策略。研究通过诱导约400kb的大片段缺失，揭示了k1C亚家族对多基因删除的补偿能力，并发现编辑系出现了蛋白结合氨基酸谱改变、蛋白体形态不规则化等典型高消化率高赖氨酸（hdhl）表型特征。尽管未观察到显著的蛋白酶组再平衡现象，但研究为谷物营养强化育种提供了重要理论依据。

　　

引言

高粱（Sorghum bicolor）作为重要的谷物作物，因其抗逆性强而广泛种植于边际土地。然而，高粱籽粒蛋白质存在必需氨基酸赖氨酸缺乏和消化率低下的问题，这主要归因于富含脯氨酸的卡非林（kafirin）贮藏蛋白占籽粒蛋白总量的70%以上，且形成的蛋白体（protein bodies）结构致密难以消化。为改善高粱营养品质，研究者尝试通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向调控α-卡非林基因家族表达，以期引发蛋白酶组再平衡（proteome rebalancing）效应。

材料与方法

研究以RTx430高粱为背景，利用特异性sgRNA构建体靶向k1C基因家族的保守序列，培育出19Q4-77 wx（含蜡质突变waxya）和19Q4-94 Wx（WAXY野生型）两个纯合编辑系。通过PacBio全长转录组测序（Iso-Seq）和全基因组测序（WGS）验证了约400kb的k1C区域缺失，该缺失涵盖7个活性基因。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白组成，透射电子显微镜（TEM）观察蛋白体形态，并系统测定了氨基酸谱、总淀粉及蛋白含量等营养指标。

结果

1. 1.
   卡非林表达与蛋白体形态
   SDS-PAGE结果显示编辑系22-kDa α-卡非林蛋白丰度与野生型无显著差异，且非卡非林蛋白未出现补偿性增加。TEM观察发现编辑系蛋白体呈现边缘不规则和内陷特征，但变形程度低于传统hdhl突变体P721Q。籽粒胚乳玻璃质比例与百粒重均保持野生型水平，表明编辑未影响籽粒物理品质。
2. 2.
   营养品质变化
   19Q4-77 wx系蛋白结合氨基酸总量显著增加（p<0.05），赖氨酸含量提升11.60%（22.04 nMol/mg），总蛋白含量增加约20%的同时总淀粉含量相应降低。值得注意的是，富含于卡非林的脯氨酸在编辑系中反而上升（19Q4-77 wx: +20.85%），提示k1C家族存在转录补偿机制。19Q4-94 Wx系除天冬氨酸（Asx）、赖氨酸（Lys）和蛋氨酸（Met）外，其他蛋白结合氨基酸均有增加。
3. 3.
   基因组与转录组特征
   PacBio WGS确认编辑系存在精确的k1C区域缺失，未发现基因重复或易位现象。Iso-Seq分析揭示野生型中仅有5个k1C基因（SbiRTX430.05G195400等）具有生物学显著表达，其中3个高表达基因位于缺失区域内。编辑系中残留的k1C基因（SbiRTX430.05G195400/195500）表达量未见显著上调，但足以维持正常卡非林合成。基因本体（GO）富集分析显示编辑系差异表达基因主要涉及核糖体结构（GO:0005840）和氧化还原过程（GO:0055114）等功能类别。

讨论

本研究揭示了高度重复基因家族对CRISPR/Cas9编辑的独特响应机制。尽管存在大规模基因缺失，k1C家族通过少数高表达基因的转录维持了蛋白稳态，这一发现对多基因家族编辑策略具有重要启示。19Q4-77 wx系表现出的蛋白-淀粉权衡效应（protein-starch tradeoff）为营养强化育种提供了新思路，而蜡质突变（wx）与k1C编辑的协同作用进一步拓展了品质改良途径。研究结果强调需开发更精准的多靶点编辑策略，以实现可预测的蛋白酶组再平衡。

结论

CRISPR/Cas9介导的k1C家族编辑能有效调控高粱氨基酸组成和蛋白含量，但高度重复基因组区域的补偿效应可能导致表型不确定性。该研究为谷物营养品质改良提供了理论依据和技术参考，对解决全球粮食安全与营养健康问题具有重要意义。