巨噬细胞自噬紊乱通过铁死亡和细胞焦亡驱动LPS诱导的全身炎症致死性休克

《Frontiers in Immunology》：Disrupted macrophage autophagy as a driver of cell death and LPS-induced lethal shock in systemic inflammation

本文揭示了在全身炎症反应综合征（SIRS）中，髓系细胞自噬缺陷（Atg5f/fLysM-cre+）通过破坏巨噬细胞表型、铁稳态（如降低GPx4、升高ROS），并诱发铁死亡、凋亡和细胞焦亡（Gasdermin D活化），从而加剧LPS诱导的组织损伤和致死性休克，为SIRS的分子机制提供了新见解。

　　

引言

全身炎症反应综合征（SIRS）可由感染性或非感染性刺激引发，并可能进展为危及生命的器官衰竭。SIRS中促炎和抗炎反应之间的平衡改变是常见现象，但驱动严重SIRS的核心分子事件仍不清楚。巨噬细胞和自噬在SIRS中的作用已被指出。本研究观察到，在髓系细胞自噬缺陷（Atg5^f/fLysM-cre⁺）的小鼠中，单次注射0.5 mg/kg的LPS后，对LPS诱导的致死性休克具有高度易感性（24小时后死亡率为60%，而野生型为0%）。使用极低剂量的LPS（0.1 mg/kg），Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠表现出快速的组织损伤，尤其是在肝脏和脾脏，并伴有巨噬细胞表型的改变。脾脏和肝脏中的巨噬细胞出现肿胀并显示细胞内容物（包括铁）的丢失。相比之下，Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠的肝细胞积累了更多的铁，这与活性氧（ROS）水平升高相关。值得注意的是，LPS处理的Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠肝脏表现出铁死亡和凋亡细胞死亡增加，脾脏和肝脏均出现广泛的细胞焦亡。流式细胞术分析、免疫荧光和RNA测序支持了LPS处理的Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠巨噬细胞具有显著的促炎表型。总之，在LPS诱导的炎症过程中，髓系细胞自噬缺陷深刻改变了巨噬细胞表型，破坏了铁运输，并通过多种形式的细胞死亡促进组织损伤。

材料与方法

使用髓系细胞特异性Atg5基因敲除小鼠（Atg5^f/fLysM-cre⁺）及其野生型同窝小鼠。小鼠单次腹腔注射不同剂量的大肠杆菌LPS（055:B5血清型）。通过临床评分、组织学（H&E染色、Perls铁染色）、免疫荧光（检测MPO、Ferroportin等）、TUNEL assay、流式细胞术（分析肝脏免疫细胞亚群，如中性粒细胞CD45⁺ Siglec-F^- CD11b⁺ Ly6G⁺和巨噬细胞CD45⁺ F4/80⁺ CD11b^low CD206⁺或CD11b⁺ Nos2⁺）、Western blot（检测Atg5、p62、LC3B-I/II、Caspase-3/8/9、GSDMD、IL-1β、IL-18、GPx4、TfR1、Ft-H等）、ELISA（检测血清细胞因子）、RNA测序（肝组织转录组分析）以及qRT-PCR等方法进行评估。数据统计采用Mann-Whitney检验或单因素方差分析（ANOVA）。

结果

髓系细胞自噬缺失加剧LPS诱导的休克

与野生型小鼠相比，Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠在注射0.5 mg/kg LPS后表现出明显的痛苦症状和死亡率（3/5）。肝组织H&E染色显示Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠肝窦扩张、免疫细胞浸润更严重，并出现含铁血黄素沉积。肝内促炎介质Il-6、Lcn2、Nos2的mRNA水平显著上调。MPO（髓过氧化物酶）阳性的中性粒细胞浸润在Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠肝脏中也显著增加。这些结果表明髓系细胞自噬缺失加剧了LPS诱导的全身炎症反应。

髓系细胞自噬缺陷促进内毒素血症期间肝脏铁失调和铁死亡

使用较低剂量LPS（0.1 mg/kg）动态观察发现，Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠在6小时即出现体重减轻和疾病症状，而野生型小鼠无明显症状。自噬激活指标显示，野生型小鼠肝脏LC3B-II水平增加且p62水平降低，而Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠p62水平高且LC3B-II水平低，表明其自噬功能受损。Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠肝脏出现红细胞浸润、肝窦充血，血清AST/ALT水平升高，促炎细胞因子（IL-1β, IL-6）水平也更高。脾脏指数在未处理的Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠中较高，LPS处理后脾脏巨噬细胞出现肿胀、细胞内容物丢失和透明样变。铁染色显示Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠肝脏铁积累增加，而脾脏巨噬细胞铁含量减少，表明铁从巨噬细胞中流失。Ferroportin（铁输出蛋白）在Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠脾脏巨噬细胞中表达较高，但在LPS处理后，其膜定位减弱，且不受肝源性Hepcidin（铁调素）下调的调节，提示存在非Ferroportin依赖的铁释放机制。ROS水平在Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠肝脏中升高，而在脾脏巨噬细胞中降低。关键抗铁死亡蛋白GPx4（谷胱甘肽过氧化物酶4）的mRNA和蛋白水平在野生型小鼠LPS处理后上调，但在Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠中无此上调，提示其抗氧化防御受损。肝脏TfR1（转铁蛋白受体1）表达降低而Ft-H（铁蛋白重链）升高，脾脏则相反，这与铁分布改变一致。体外BMDM（骨髓来源巨噬细胞）实验证实，LPS诱导野生型巨噬细胞自噬（LC3B脂化），并伴有Ferroportin降解、细胞内不稳定铁池（LIP）和ROS增加；而Atg5缺陷的BMDM则表现出较低的LIP和ROS水平。

自噬缺陷的巨噬细胞诱导巨噬细胞死亡

LPS处理后，Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠肝脏出现更多凋亡特征（核固缩、碎裂）和TUNEL阳性细胞。Western blot显示其肝脏中凋亡起始因子（Cleaved Caspase-9, Caspase-8）和效应因子（Cleaved Caspase-3）以及焦亡关键蛋白（Cleaved GSDMD, IL-18）的活化水平均高于野生型。脾脏中，Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠也表现出NLRP3、Cleaved Caspase-8/9和GSDMD的高表达。巨噬细胞形态学改变（肿胀、透明 cytoplasm）提示细胞焦亡导致的膜完整性破坏。BMDM实验也验证了Atg5缺陷巨噬细胞在LPS刺激下Caspase-3、Caspase-9和Cleaved IL-18表达更高。这表明自噬缺陷促进了巨噬细胞通过凋亡和焦亡途径死亡。

自噬缺陷巨噬细胞促进促炎巨噬细胞极化

流式细胞术分析显示，LPS注射后，Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠肝脏中浸润的CD45⁺ Siglec-F^- CD11b⁺ Ly6G⁺中性粒细胞比例随时间持续升高（6小时达82%），而野生型小鼠先升高后下降。对于巨噬细胞，野生型小鼠LPS刺激后CD45⁺ F4/80⁺ CD11b⁺ Nos2⁺（M1型）比例早期升高后下降；而Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠该M1亚群比例呈现延迟但持续的升高。免疫荧光显示腹腔巨噬细胞在LPS处理后CD206（M2标志）减少，CD68（吞噬活性标志）增加，且Atg5缺陷巨噬细胞的Nos2表达强度和持续时间更长，培养上清中TNF-α和IL-1β分泌也更高。铁处理（FAC）可降低Atg5缺陷BMDM的M2标志物（Retlna, Mrc1, Il-10）表达并增加Tnfα表达，表明铁代谢紊乱影响极化。

RNA-Seq分析证实自噬缺陷巨噬细胞小鼠存在应激相关改变

肝组织RNA测序显示，与野生型相比，LPS刺激的Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠中，与氧化应激和铁代谢相关的基因（Hif1a, Hp, Hpx, Lcn2, Slc11a2）上调，而Slc40a1（Ferroportin）和Keap1（Nrf2抑制剂）下调。聚焦炎症和应激反应基因集发现，Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠中促炎通路基因（Rela, Myd88, Irf1, Nlrp6）和细胞因子（Il1β, Il18, Il6st, Tnfap3）表达上调，抗炎基因（Ikkb, Cd55, Tab2）下调。细胞焦亡通路基因（Casp3, GsdmD）表达升高，抗凋亡基因Bcl2l2下调。参与囊泡运输（如Rab, Atg家族）的基因在野生型小鼠中上调更明显。急性期蛋白基因（Hp, Hpx, Lcn2, Hmox）在野生型中上调显著，而Atg5^f/fLysM-cre⁺小鼠中铁代谢相关基因（Lcn2, Hamp1, Slc11a2）上调，Slc40a1下调，抗氧化基因（Hif1α, Sod2, Gpx4）表达受损。这从转录组水平支持了自噬缺陷导致铁代谢紊乱、氧化应激加剧和促炎状态。

讨论

本研究证明髓系细胞自噬在抵御严重急性全身炎症中起保护作用。自噬缺陷小鼠对低剂量LPS高度敏感，表现为独特的病理特征：血管充血、促炎细胞因子升高、巨噬细胞铁耗竭伴肝细胞铁超载和ROS升高、以及铁死亡、凋亡和焦亡等多种细胞死亡形式的激活。自噬通过调节巨噬细胞极化（偏向M1表型）、中性粒细胞浸润、铁稳态（如调控Ferroportin周转）和抗氧化防御（如GPx4）来限制炎症损伤。自噬缺陷导致巨噬细胞死亡方式向促炎性的焦亡倾斜（Gasdermin D活化，IL-1β/IL-18释放），并可能通过Gasdermin D孔道促进铁外流，加剧局部铁失调。肝脏中ROS和铁超载触发的凋亡和铁死亡，以及脾脏巨噬细胞的功能障碍，共同导致了SIRS的恶化。该研究揭示了巨噬细胞自噬在协调炎症反应和细胞死亡中的核心地位，为理解SIRS发病机制和寻找治疗靶点提供了新视角。

研究局限性

本研究观察到自噬缺陷小鼠巨噬细胞铁耗竭，但未能排除中性粒细胞自噬的潜在贡献。组织染色方法难以实现多指标共定位分析，无法确定不同细胞死亡途径是否发生于同一细胞。使用特异性抑制剂有助于阐明各死亡通路的主要作用。