丙型肝炎病毒感染患者使用芬太尼后单细胞RNA转录组反应

《Frontiers in Virology》：Single cell RNA transcriptome response to fentanyl use in persons with hepatitis C virus infection

本研究通过单细胞RNA测序分析HCV感染者使用芬太尼前后的外周血免疫细胞基因表达谱，发现106个差异表达基因，涉及宿主抗病毒机制，其中7个基因在多细胞类型中共现，提示芬太尼可能通过干扰免疫应答影响HCV病理进程。

　　近年来，美国面临严重的药物滥用危机，其中合成阿片类药物如芬太尼的使用尤为突出。芬太尼作为一种强效的镇痛药，其非法使用导致了大量过量死亡事件，并与肝炎病毒（HCV）感染率上升密切相关。HCV感染在全球范围内影响了约5000万人，尽管直接作用抗病毒药物（DAAs）能够治愈95%以上的感染者，但诊断率和治疗可及性在某些高危人群中仍较低。HCV感染率在2013年至2021年间持续上升，且目前仍高于年度目标。药物使用者（PWID）是HCV感染和再感染的主要风险群体，特别是在使用注射药物的情况下，血液暴露是主要传播途径之一。

芬太尼的使用不仅限于医疗用途，其非法使用和滥用现象日益严重。2018年，美国估计有369万PWID，占成人人口的1.46%。2021年，美国因药物相关过量死亡人数超过10万，其中合成阿片类药物（如芬太尼）的过量死亡比例显著上升。芬太尼的广泛使用导致了HCV和HIV感染的增加，例如2015年印第安纳州的HIV/HCV爆发事件，以及阿巴拉契亚和新英格兰部分地区的情况。全球范围内，PWID中HCV感染率从每100人年0.2到72.5不等，平均为12.1。

阿片类药物受体在多种免疫细胞中广泛表达，包括CD4+ T淋巴细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞。此外，阿片类药物受体在肝脏中也存在，特别是在肝细胞和肝星状细胞中，这些受体在疾病进展中起着重要作用。已有研究表明，常见的阿片类药物及其受体能够促进病毒复制和病毒介导的病理过程，例如在HIV感染中，多种阿片类药物通过增加趋化因子受体表达、抑制β趋化因子、抑制内源性干扰素反应和调节微小RNA表达等方式增强病毒复制。然而，关于阿片类药物对HCV及其肝病的影响，研究仍较为有限。

在体外实验中，吗啡、海洛因和甲基苯丙胺已被证实能够增强HCV复制。近期的一项研究进一步表明，芬太尼能够以剂量依赖性方式促进HCV复制，并导致显著的细胞凋亡。RNA测序结果显示，芬太尼暴露的肝细胞中存在多个差异表达的基因，包括与抗病毒干扰素反应、NFκB信号通路、趋化因子信号通路和细胞凋亡相关的基因。尽管已有研究发现芬太尼与HCV血清转换率增加有关，但仍需更多研究来揭示其作用机制。

为了深入了解芬太尼对HCV感染者的免疫系统影响，本研究评估了HCV感染者近期使用芬太尼对外周血基因表达谱的影响。研究共纳入11名参与者，包括4名HCV阴性健康对照者、4名当前使用芬太尼的HCV阳性个体，以及3名未使用芬太尼的HCV阳性个体。研究结果显示，HCV阳性个体的中位病毒载量为5.6 log10 copies/mL。芬太尼使用状态对细胞频率的影响仅在非CD4+、非CD8+ T细胞中有所体现，其比例在芬太尼使用者中更高（p = 0.052）。通过比较HCV阳性个体中芬太尼检测阳性和阴性者的基因表达差异，共鉴定出106个差异表达基因（DEGs），其中11个位于CD4+ T淋巴细胞中，46个位于CD8+ T淋巴细胞中，5个位于单核细胞中，13个位于B淋巴细胞（排除浆细胞）中，24个位于浆细胞中，2个位于树突状细胞中，13个位于自然杀伤（NK）细胞中。这些DEGs中，有7个基因在多种细胞类型中被共同表达，主要包括与抗病毒机制相关的基因。例如，ISG15在CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B淋巴细胞中均被上调，而HLA-C在B淋巴细胞和树突状细胞中被下调。此外，PARP8在CD8+ T细胞和NK细胞中被下调，而GZMA和PRKX在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中被上调。

通过富集分析，研究发现这些差异表达基因涉及多种细胞过程和表型。例如，在CD4+ T细胞中，ISG15参与了“ISG15-蛋白连接”和“细胞蛋白降解过程”，而ABCG2则与“血脑屏障中的外源性物质转运”相关。在CD8+ T细胞中，CX3CR1和ITGAM与“海马神经元凋亡调节”和“小胶质细胞介导的细胞毒性调节”有关，IFNG、CX3CR1和ITGAM则与“小胶质细胞激活”相关。此外，IFNG和CD300A参与了“磷酸酶活性的正向调节”，CX3CR1和CD300A则与“髓系白细胞介导的免疫负向调节”有关。这些基因的表达变化可能反映了芬太尼对免疫系统功能的复杂影响。

在单核细胞中，SYNGR1与“短期神经突触可塑性调节”和“长期神经突触可塑性调节”相关，而H1-3则与“基因沉默的负向调节”、“染色质沉默的负向调节”和“染色质组织的负向调节”有关。此外，MARCO基因属于“吞噬体”通路。在B淋巴细胞（排除浆细胞）中，ANK3与“钠离子跨膜转运的正向调节”和“钠离子跨膜转运体活性的调节”相关，HLA-C和ISG15则与“I型干扰素信号传导”和“细胞对I型干扰素的反应”有关。IL7R、HLA-C、ISG15和GRAP2则与“细胞因子介导的信号传导”相关。HLA-C和ISG15还参与了“Epstein-Barr病毒感染”和“人乳头瘤病毒感染”通路，而IL7R则与“原发性免疫缺陷”通路相关。

在浆细胞中，HMGB2和HMGB1与“V(D)J重排”和“DNA拓扑变化”相关，HMGB2还参与了“染色质组装”过程，而NUSAP1则与“染色体凝聚”有关。此外，H2BC7、HMGB1和H2AZ1在“中性粒细胞胞外陷阱形成”和“坏死性凋亡”通路中起作用，而H2BC7和H2AZ1还参与了“酒精成瘾”和“系统性红斑狼疮”通路。在树突状细胞中，HLA-C与“外源性肽抗原通过MHC I类分子的抗原处理和呈递”和“内源性肽抗原通过MHC I类分子的抗原处理和呈递”相关，HLA-DRB5和HLA-C还参与了“干扰素γ介导的信号传导”和“细胞对干扰素γ的反应”通路。这些基因的表达变化可能反映了芬太尼对免疫系统不同细胞类型的影响。

在NK细胞中，LDLR与“星形胶质细胞激活的调节”和“溶酶体中蛋白质降解过程的正向调节”相关，而GZMB则参与了“移植物排斥”、“I型糖尿病”和“移植物对宿主病”通路。PTPN6和GZMB则与“NK细胞介导的细胞毒性”通路相关，LDLR还参与了“胆固醇代谢”通路。此外，研究还评估了干扰素（IFN）和干扰素刺激基因（ISG）在HCV感染者中与芬太尼使用的关系。结果显示，ISG15和IFNG在芬太尼使用者和非使用者之间存在差异表达。ISG15在CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B淋巴细胞（排除浆细胞）中均被上调，而IFNG则在CD8+ T细胞中被上调。这些基因的表达变化可能反映了芬太尼对HCV感染者的免疫反应的调节作用。

尽管HCV主要在肝细胞中复制，但已有证据表明HCV在肝脏以外的组织中也能复制。此外，某些病毒蛋白与宿主细胞的糖蛋白结合可能改变细胞功能，而无需活跃的病毒复制。关于药物使用期间HCV进入因子的表达情况，目前的研究较为有限。Carrière等人通过流式细胞术评估了PBMC中LDLR和CD81的表达情况，发现CD81在中度饮酒者中被上调。Sandau等人发现甲基苯丙胺使用会增加含有CD81的血浆外泌体数量。Cocaine也会在大鼠大脑中诱导CD81表达。然而，关于芬太尼及其类似物对HCV进入因子表达的影响，目前尚无相关研究。在本研究中，CD81在外周血中的表达水平较高，但其他HCV进入因子如L-SIGN/CLEC4M和NPC1L1并未被检测到。

本研究存在一些局限性。首先，样本的横断面收集方式限制了对转录变化随时间演变的观察，以及对药物使用引起的肝病进展的追踪。其次，样本量较小可能影响统计功效，降低对不同组别和细胞类型间细微差异的检测能力。然而，单细胞转录组分析所需的样本数量取决于具体的研究问题、患者群体的异质性和分析的复杂性。此外，传统的统计功效评估和样本量计算方法可能不足以满足单细胞RNA测序的需求，因此可能需要采用非传统的统计方法。第三，本研究未能区分急性与慢性阿片类药物暴露对HCV复制和病理过程的影响，而这类区分可能对理解药物使用对HCV的影响至关重要。第四，本研究主要关注芬太尼的使用，但其他毒品的使用可能对外周血转录组产生不同的影响。此外，多物质滥用在阿片类药物使用人群中较为常见，但在病毒感染的临床队列中通常未被充分考虑，因此无法评估多种非法药物之间的协同效应或药物相互作用。第五，由于缺乏肝活检，无法对肝纤维化进行详细分析，但考虑到非侵入性方法的普及，肝活检的使用频率已显著降低。最后，功能研究是必要的，以全面验证本研究中发现的基因表达变化及其在体内的意义。

综上所述，本研究的结果揭示了芬太尼使用如何通过多种不同的途径影响HCV的发病机制。明确外周血转录组的变化对于更深入地理解病毒-细胞-阿片类药物之间的相互作用至关重要，并可能有助于改善高危人群的临床管理，以及发现新的治疗靶点和策略。这些发现为未来的治疗方案提供了潜在的方向，同时也强调了进一步研究的必要性，以更全面地了解芬太尼和其他阿片类药物对HCV感染者的免疫系统和病毒复制的影响。