氧化低密度脂蛋白与剪切力在钙化主动脉瓣疾病芯片平台中的诱导钙化作用

《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：Oxidative low-density lipoprotein and shear induced calcification within a calcific aortic valve disease-on-a-chip platform

钙化性主动脉瓣病（CAVD）早期病理特征为免疫细胞浸润、细胞外基质（ECM）重构及氧化低密度脂蛋白（oxLDL）沉积。本研究采用3D微流控芯片模型，通过动态培养（20 dyne/cm2）和oxLDL处理（25/50 μg/ml），探讨内皮细胞存在对钙化进程的影响。结果表明：动态培养联合oxLDL显著增强ALP活性（p<0.05）和硫酸化GAG生成，诱导羟基磷灰石（Ca/P=1.67）形成，且内皮细胞与 oxLDL相互作用导致膜孔频率增加（1.9±0.3 vs 3.2±0.5，p<0.05），提示剪切应力与内皮功能障碍在CAVD早期钙化中起关键作用。

　　钙化性主动脉瓣疾病（Calcific Aortic Valve Disease, CAVD）是一种影响心脏瓣膜功能的严重病理过程，尤其在西方国家中，其发病率位居第三，仅次于冠状动脉疾病和高血压。CAVD的发展过程包括从早期的瓣膜增厚（称为主动脉硬化）到晚期严重的瓣膜钙化（主动脉狭窄）。这一疾病不仅导致瓣膜结构的破坏，还可能引发血流受限，最终影响心脏的正常运作。近年来，研究者们逐渐认识到，CAVD并非单纯的退行性病变，而是一个复杂的病理生物学过程，涉及免疫细胞浸润、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑以及低密度脂蛋白的氧化沉积（oxLDL）。因此，理解CAVD的早期机制对于开发新的治疗策略至关重要。

在实验室研究中，CAVD通常被划分为两个阶段：早期阶段和晚期阶段。早期阶段的特征包括ECM的降解和重构，以及氧化低密度脂蛋白（oxLDL）的沉积和氧化。随着疾病的发展，钙化斑块逐渐形成并扩展，导致瓣膜组织变硬和功能障碍。因此，研究CAVD的早期阶段，特别是oxLDL的沉积、免疫反应以及细胞间相互作用，有助于揭示疾病的起始机制，并为潜在的治疗手段提供理论基础。

当前，针对CAVD的治疗手段仍较为有限，多数患者依赖手术置换瓣膜。然而，手术并非所有患者的首选方案，尤其是对于早期病变或高龄患者而言。因此，研究者们正在探索非手术的干预方法，以延缓或阻止疾病的进展。这些研究主要集中在对疾病机制的理解上，包括氧化应激、脂质沉积、免疫反应和细胞外基质的变化。例如，oxLDL已被证明可以激活 Toll-like 受体（TLRs）-2 和 -4，促进钙化过程，并影响细胞增殖和分化。此外，一些研究发现，oxLDL与脂质代谢、炎症反应和细胞凋亡密切相关，这些因素共同作用，推动了钙化过程的进行。

为了更深入地研究CAVD的早期机制，科学家们开发了多种体外模型，包括二维细胞培养和三维组织工程模型。其中，基于微流控技术的CAVD-on-a-chip模型被认为是研究该疾病的重要工具。这种模型可以模拟主动脉瓣组织的三维结构，并在体外重现其生理和病理环境。通过该模型，研究者能够观察到细胞在不同条件下（如静止状态与动态剪切应力）的行为变化，以及oxLDL在其中的作用。

在本研究中，采用了一种基于微流控技术的CAVD-on-a-chip平台，重点研究了早期CAVD中钙化现象的变化。该平台由含有猪主动脉瓣间质细胞（PAVIC）的胶原蛋白I（COL-I）水凝胶构成，并在水凝胶表面接种猪主动脉瓣内皮细胞（PAVEC）。通过模拟静止状态和动态剪切应力（20 dyne/cm2）下的环境，研究人员评估了不同条件下钙化程度的变化。研究结果显示，动态剪切应力和内皮细胞的存在显著促进了碱性磷酸酶（ALP）活性的增加，以及硫酸化糖胺聚糖（GAG）和单钙磷酸盐、双钙磷酸盐、八钙磷酸盐及羟基磷灰石的形成。此外，oxLDL的浓度也对钙化过程产生了影响，尤其是在动态条件下，较高浓度的oxLDL（如50 μg/ml）会显著降低ALP活性和GAG的相对产量，但同时促进钙磷沉积，形成羟基磷灰石。

通过扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDX）分析，研究人员能够直观地观察到钙化斑块的形成及其组成。在动态剪切条件下，细胞在水凝胶中表现出更强的钙磷沉积能力，这与羟基磷灰石的形成密切相关。同时，荧光显微镜用于检测oxLDL与细胞的相互作用，结果显示在25 μg/ml和50 μg/ml的oxLDL浓度下，细胞能够有效摄取这些脂蛋白，从而影响其功能和结构。这些发现表明，oxLDL不仅在促进钙化方面起关键作用，还可能通过影响内皮细胞的完整性，间接导致ECM的重塑和钙化斑块的形成。

内皮细胞在主动脉瓣结构中具有重要的功能，它们不仅提供机械支持和弹性，还参与调节血流和免疫反应。然而，当内皮细胞受到oxLDL刺激时，其功能会受到损害，表现为细胞膜上的微孔增多，细胞通透性增加。这一现象在本研究中得到了验证，通过SEM图像和定量分析，研究人员发现oxLDL浓度的增加与内皮细胞膜上孔的数量和大小呈正相关。这种内皮细胞的损伤可能进一步促进脂质和钙沉积，导致疾病的发展。此外，研究还表明，剪切应力和oxLDL的共同作用可能通过激活特定的信号通路（如NFκB和BMP通路）来促进钙化过程，这为理解CAVD的发病机制提供了新的视角。

研究还探讨了oxLDL对细胞外基质（ECM）的影响。ECM的重塑是CAVD的一个重要特征，表现为胶原蛋白的沉积、蛋白聚糖的富集以及弹性纤维的断裂。在本实验中，研究人员发现，oxLDL的加入会改变ECM的结构和组成，促进钙磷沉积，进而导致羟基磷灰石的形成。这一过程可能与氧化应激有关，因为oxLDL的氧化作用会引发活性氧（ROS）的积累，而ROS在细胞信号传导和钙化过程中起着关键作用。例如，一些研究指出，ROS可以促进骨形态发生蛋白（BMP）的激活，从而加速钙化过程。

本研究的创新之处在于，利用微流控平台模拟了主动脉瓣的三维结构，并结合动态剪切应力和oxLDL的加入，全面评估了钙化过程的多个方面。这种方法不仅能够更真实地反映体内环境，还能提供高通量的实验条件，便于研究不同变量对疾病进展的影响。此外，通过整合多种检测手段（如ALP活性检测、GAG产量分析、SEM/EDX和荧光显微镜），研究人员能够从多个层面了解钙化过程的机制，从而为未来的药物开发和治疗策略提供依据。

值得注意的是，虽然本研究主要关注早期CAVD的机制，但其结果也为理解晚期阶段的病理变化提供了线索。例如，内皮细胞的损伤可能导致更多的脂质和钙沉积，而这些沉积物可能进一步引发炎症反应和纤维化。因此，未来的研究可以进一步探索CAVD的长期进展，以及不同治疗策略对疾病各阶段的影响。

总的来说，本研究通过建立一个基于微流控技术的CAVD-on-a-chip模型，揭示了oxLDL、剪切应力和内皮细胞在早期CAVD钙化过程中的作用。这些发现不仅加深了对CAVD发病机制的理解，也为开发新的治疗方法提供了重要的实验依据。随着对疾病机制研究的不断深入，未来有望通过靶向干预这些关键因素，为CAVD患者带来更有效的治疗选择。