DNase I通过抑制NETs形成缓解MRL/lpr小鼠肾脏炎症损伤的作用与机制研究

《Frontiers in Immunology》：DNase I alleviates renal inflammatory injury in MRL/lpr mice by inhibiting NETs formation

本研究揭示了DNase I通过靶向降解中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），抑制NETs/Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MYD88）信号轴，进而减少T细胞、巨噬细胞等免疫炎症细胞浸润，从而缓解狼疮性肾炎（LN）模型小鼠肾脏炎症损伤的创新机制。文章综合运用体内外模型及RNA测序（RNA-seq）等技术，证实了关键分子肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（PADI4）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、TLR4和MYD88在NETs介导的肾损伤中的重要作用，为LN的临床防治提供了新的潜在靶点和策略。

　　

1 引言

狼疮性肾炎（LN）是系统性红斑狼疮（SLE）最常见且可能危及生命的严重并发症，其发病机制涉及多种免疫细胞。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成与肾脏炎症损伤密切相关，但其具体的病理生理机制尚未完全阐明。中性粒细胞作为血液中最丰富的先天免疫细胞，在LN发病中起关键调控作用。除了通过吞噬作用直接损伤肾脏固有细胞外，中性粒细胞还能通过释放由染色质纤维（携带免疫刺激分子）以及胞浆和中性粒细胞颗粒中的多种酶和蛋白质组成的NETs，诱导肾脏组织坏死和炎症自我放大循环。NETs的形成过程称为NETosis，涉及多种蛋白激酶的激活，包括PADI4催化的组蛋白H3精氨酸残基瓜氨酸化（驱动染色质解凝）、蛋白激酶Cα（PKCα）介导的核纤层蛋白B磷酸化（导致核膜破裂）以及细胞骨架重塑（特别是肌动蛋白细胞骨架解聚，促进质膜破裂和NETs释放）。研究表明，LN患者肾小球炎症损伤区域存在NETs，且其浸润程度与LN病理表现呈正相关。NETs可通过暴露组蛋白-DNA复合物激活体内Toll样受体（TLRs），从而促进浆细胞样树突状细胞产生I型干扰素。在肝脏炎症损伤模型中，PADI4抑制剂或DNase I处理可通过靶向抑制或降解NETs显著保护肝细胞并减轻炎症反应。DNase I也被证明能显著降低血管炎大鼠肾脏中的NETs水平，减少炎症细胞浸润，减轻器官炎症损伤。前期研究证实DNase I能有效靶向降解LN小鼠模型肾脏中的NETs并显著改善肾功能，但其通过靶向NETs减轻LN肾脏炎症损伤的具体分子机制仍有待深入阐明。

2 方法

2.1 小鼠与实验处理

动物实验经内蒙古医科大学附属医院医学伦理委员会批准。使用6-8周龄雌性MRL/lpr小鼠和8周龄雌性C57BL/6J小鼠。MRL/lpr小鼠从17周龄开始每天腹腔注射DNase I，直至21周龄处死。

2.2 血清和尿液样本的收集与生化分析

在21周时收集血清和尿液样本。采用ELISA法测定血清抗双链DNA（anti-dsDNA）浓度，考马斯亮蓝（CBB）法测定尿蛋白浓度，肌酸酶偶联肌酸氧化酶法测定血清肌酐浓度，脲酶法测定血清尿素氮浓度。

2.3 组织学检查

肾组织经石蜡包埋切片后，进行苏木精-伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色、Masson染色评估。使用ImageJ软件量化胶原阳性区域。

2.4 免疫荧光和免疫组化分析

使用抗髓过氧化物酶（MPO）、抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、抗瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）等抗体对肾组织切片进行免疫荧光和免疫组化染色。从狼疮肾炎患者和健康对照者血液中分离中性粒细胞，用佛波酯（PMA, 25 ng/mL）、DNase I（1 mg/mL）等处理后进行免疫荧光染色。

2.5 蛋白质印迹分析

使用RIPA裂解液制备全细胞和组织裂解液。抗体包括NE、CitH3、TLR4、MYD88、IL6、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等，GAPDH作为内参。

2.6 RNA-seq处理与分析

对小鼠肾组织进行RNA测序。使用DESeq2软件标准化数据，筛选差异表达基因（DEGs）（校正q值<0.05且log2 |倍数变化（FC）| > 2）。进行Reactome通路富集分析、基因本体论（GO）富集分析和基因集富集分析（GSEA）。使用TIMER算法估算肾脏免疫细胞亚群比例。

2.7 流式细胞术

分离小鼠脾脏淋巴细胞，使用抗CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、Foxp3等抗体染色，通过流式细胞仪分析淋巴细胞亚群比例。

2.8 RNA分离与RT-PCR

使用RNA提取试剂盒从小鼠肾脏、脾脏或中性粒细胞中提取总RNA，反转录为cDNA后进行定量PCR。使用2^-△△Ct方法计算相对基因表达量，以β-肌动蛋白（β-Actin）或GAPDH mRNA作为内参。

2.9 统计分析

使用GraphPad Prism 6.0进行统计分析。组间比较采用t检验（两组）或单因素方差分析（多组）。P < 0.05认为有统计学意义。

3 结果

3.1 DNase I减轻MRL/lpr小鼠狼疮样症状并缓解肾脏病理损伤

MRL/lpr小鼠在18周龄时开始出现头面部和躯干皮肤损伤，淋巴结、脾脏和肾脏明显肿大。经4周DNase I治疗后，皮肤损伤、脱毛、淋巴结病、脾肿大和肾脏肿大均得到改善，体重下降被遏制。组织学检查显示，21周龄MRL/lpr小鼠模型组出现肾小球免疫复合物沉积、肾间质炎症细胞浸润和肾小球新月体形成，而DNase I治疗组肾小球损伤较轻，仅见中度系膜和内皮细胞增生，炎症细胞浸润减少。Masson三色染色和统计分析表明，MRL/lpr小鼠肾脏胶原沉积显著增加，DNase I治疗后显著改善。病理评分显示，模型组系膜细胞增生、PAS阳性沉积、新月体病变和肾小管损伤明显，而治疗组这些损伤指标显著降低。

3.2 DNase I改善疾病活动度和肾功能并抑制MRL/lpr小鼠肾脏NETs形成

21周龄MRL/lpr小鼠模型组血清抗dsDNA、ANA、肌酐、尿素氮和尿蛋白浓度显著升高，DNase I治疗组则显著降低，其中血清尿素氮水平恢复至正常。免疫组化染色显示DNase I治疗后LN小鼠肾脏IgG抗体沉积减少。免疫荧光显示，与正常对照相比，MRL/lpr小鼠肾脏MPO和CitH3强阳性表达，NETs主要沉积在肾小球，部分在肾间质，DNase I治疗后这些标志物表达显著降低。免疫组化显示MRL/lpr小鼠肾脏NE和CitH3阳性细胞数显著高于正常对照，治疗后显著减少。蛋白质印迹进一步证实DNase I治疗组肾脏NE和CitH3蛋白表达显著降低。

3.3 RNA-seq揭示MRL/lpr小鼠肾脏中性粒细胞活化及DNase I治疗后免疫细胞趋化性下调和损伤修复通路上调

RNA-seq分析发现，与对照相比，MRL/lpr小鼠肾脏有1265个上调DEGs和533个下调DEGs；而与模型组相比，DNase I治疗组有8个上调基因和19个下调基因。主成分分析（PCA）显示三组间存在差异且生物重复性好。Reactome富集分析表明，LN模型肾脏DEGs显著富集于中性粒细胞活化通路，而治疗组DEGs更多富集于氨基酸代谢、细胞外基质（ECM）组织和降解通路。GO富集分析显示模型组DEGs主要富集于免疫系统激活、炎症反应和T细胞活化通路，治疗组则富集于上皮间质转化（EMT）正调控和上皮细胞增殖等损伤修复相关通路。GSEA显示模型组中性粒细胞脱颗粒、T细胞活化和趋化因子活性相关反应显著上调，治疗后中性粒细胞趋化性、T细胞介导的细胞毒性和趋化因子相关分子通路显著下调。

3.4 DNase I减轻细胞毒性免疫细胞浸润并下调炎症损伤通路和NETs形成相关分子表达

TIMER算法估计显示，与正常对照相比，MRL/lpr小鼠肾脏中性粒细胞、细胞毒性CD8⁺ T细胞、B细胞、树突状细胞（DCs）和巨噬细胞数量显著增加，CD4⁺ T细胞数量减少；DNase I治疗后这些免疫细胞数量减少，CD4⁺ T细胞数量增加。流式细胞术显示，模型组脾脏CD3⁺CD4⁺ T细胞比例显著低于对照，CD3⁺CD8⁺ T细胞比例显著升高，治疗后均趋于正常。模型组脾脏CD3^-CD19⁺ B细胞比例显著增加，治疗后显著降低。模型组脾脏CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Tregs）显著减少，治疗后有效恢复。

实时PCR显示，模型组肾脏和脾脏炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17、iNOS）mRNA表达显著上调，治疗后显著下调。模型组肾脏凋亡和损伤基因（Caspase3、Caspase9、Bax、Kim1）和趋化因子CCL2 mRNA表达增加，抗凋亡分子Bcl2表达下调，治疗后这些变化逆转。炎症细胞信号通路分子（TLR4、MYD88、HMGB1）及NETs形成关键分子PADI4在模型组高表达，治疗后显著下调。RNA-seq基因聚类分析和蛋白质印迹验证了上述结果。

3.5 DNase I在体外抑制NETs形成并调节炎症通路和NETs关键分子表达

从健康人供体分离中性粒细胞，用PMA诱导活化形成NETs。免疫荧光显示PMA处理组形成丝状网络结构，MPO和CitH3高表达，加入DNase I后MPO和CitH3表达显著降低，丝状结构明显减少。与正常对照相比，PMA处理组促炎基因IL-1β、TNF-α和趋化因子CCL2 mRNA表达显著上调，抗炎修复基因IL-10和TGF-β表达下调；PMA+DNase I组IL-1β、TNF-α、CCL2 mRNA水平降低，IL-10和TGF-β mRNA水平升高。PMA处理组NETs形成关键分子PADI4及炎症通路分子TLR4、MYD88、HMGB1表达强劲，PMA+DNase I组其mRNA水平显著减弱。相关性分析显示PADI4 mRNA表达与炎症通路分子MYD88、IL-1β、TNF-α表达呈正相关，与损伤修复基因TGF-β表达呈负相关。LN患者外周血中性粒细胞PADI4、TLR4、MYD88、HMGB1 mRNA表达显著高于健康对照。

3.6 MRL/lpr小鼠肾脏NETs及炎症关键分子表达随时间推移逐渐上调并与肾脏NETs形成正相关

实时PCR评估显示，与同龄对照相比，MRL/lpr小鼠肾脏PADI4、TLR4、MYD88、HMGB1 mRNA表达显著上调，且随周龄增加表达倍数逐渐升高。免疫荧光显示17、19、21周龄MRL/lpr小鼠肾脏MPO⁺ CitH3⁺双阳性细胞数显著高于正常对照，并呈逐渐上升趋势。免疫组化显示MRL/lpr小鼠肾脏NE和CitH3阳性细胞数在17、19、21周时均显著增加。相关性分析显示PADI4、TLR4、MYD88、HMGB1 mRNA表达与MPO⁺ CitH3⁺双阳性细胞数呈正相关。

4 讨论

本研究证实MRL/lpr小鼠模型中中性粒细胞活化形成的NETs诱导了肾脏炎症损伤。研究发现NETs通过上调中性粒细胞中TLR4、MYD88、核因子κB（NF-κB）、IL-1β、IL-6、CCL2等关键炎症信号通路组分，增强NETs形成关键分子PADI4的表达，促进NETs积累和T细胞、巨噬细胞等免疫炎症细胞浸润，导致肾脏炎症损伤。靶向降解NETs的DNase I能显著缓解LN中NETs介导的肾损伤。

DNase I作为NETs降解酶，虽因人体内存在DNase I抑制剂和抗NETs抗体而应用受限，但已在多种NETs介导的炎症性组织器官损伤动物模型中广泛应用。本研究RNA-seq分析表明，DNase I治疗后肾脏免疫细胞浸润和活化减少，炎症损伤分子表达下降，抗凋亡修复分子表达增加，ECM降解和重塑通路激活，这可能与NETs直接与ECM成分相互作用促进其重塑和沉积有关。

NETs可通过多种机制诱导组织器官炎症损伤。本研究观察到LN小鼠肾脏TLR4、MYD88、IL-6等关键炎症通路分子mRNA和蛋白表达显著上调，治疗后随炎症改善而下调，提示LN肾炎炎症损伤与NETs介导的TLR4/MYD88通路激活密切相关。NETs中高度碱性的组蛋白可作为损伤相关分子模式（DAMPs）与TLR4结合触发炎症反应。NETs的促炎活性关键依赖于MYD88/NF-κB下游信号通路激活。HMGB1作为DAMPs，可通过激活TLR4/MYD88通路促进NETs形成。本研究证实HMGB1基因显著上调，且组蛋白和HMGB1可能通过TLR4和TLR9信号通路增强PADI4激活，促进NETs形成，从而建立NETs积累和持续炎症损伤的闭环。

活化的中性粒细胞形成NETs并释放趋化因子，协同促进细胞毒性免疫细胞向组织器官浸润活化，是NETs介导炎症损伤的另一关键机制。中性粒细胞可产生多种趋化因子，主要介导中性粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等向炎症损伤部位趋化。本研究RNA-seq和实时PCR证实MRL/lpr小鼠肾脏多种趋化分子上调，CCL2表达增加，其在LN肾脏巨噬细胞和中性粒细胞趋化中起关键作用。NETs可激活其他免疫细胞，如NETs的DNA成分通过TLR9/NF-κB通路激活并极化促炎巨噬细胞；含有MPO和HMGB1的NETs可刺激浆细胞样树突状细胞产生抗病毒因子；NETs与T细胞受体相互作用可降低T细胞活化阈值，增强特异性免疫应答，促进T细胞招募和TNF、IFN-γ、IL-6等细胞因子分泌；外源性NETs与免疫细胞共培养可激活Th17细胞诱导炎症反应。本研究及近期LN研究均发现DNase I治疗可恢复Tregs水平，缓解疾病症状。

NETs在急性肾损伤、糖尿病肾病、LN等疾病中形成并介导肾脏炎症损伤。PADI4作为NETs形成过程中瓜氨酸化的经典必需分子，在SLE和LN发病中起关键作用，其表达显著激活且与NETs形成密切关联。PADI4基因敲除小鼠肾中性粒细胞浸润和NETs产生显著减少，肾功能明显改善，因此PADI4不仅是肾脏炎症损伤的分子标志物，也是靶向NETs治疗肾脏疾病的关键靶点。除PADI4外，HMGB1、TLR4、MYD88等关键标志物在肾脏炎症损伤后被激活，在LN患者外周血中性粒细胞、体外细胞模型和体内动物模型中高表达，且随疾病进展表达水平显著上升，与肾脏NETs形成正相关，可作为NETs介导LN肾脏炎症损伤的新型分子标志物，为该病的预防、诊断和治疗提供新靶点。

5 结论

中性粒细胞活化形成的NETs在LN小鼠肾脏炎症损伤过程中起关键作用。DNase I通过抑制LN小鼠肾脏NETs产生，减轻肾脏炎症损伤。NETs/TLR4/MYD88信号通路促进NETs形成并诱导T细胞、巨噬细胞等免疫炎症细胞浸润，最终介导肾脏炎症损伤。鉴定出与NETs诱导肾损伤密切相关的分子标志物（PADI4、HMGB1、TLR4、MYD88），为狼疮性肾炎的临床防治提供了新策略。