综述：霉菌毒素诱导免疫毒性中的昼夜节律：一个新兴的调控轴？

《Frontiers in Pharmacology》：Circadian rhythm in mycotoxin-induced immunotoxicity: an emerging regulatory axis?

本综述系统阐述了霉菌毒素（如DON、ZEA）通过干扰核心生物钟基因（如BMAL1、CLOCK）表达，破坏宿主昼夜节律，进而与氧化应激（ROS）、免疫抑制（如PD-L1上调）形成恶性循环，加剧多器官毒性这一新兴调控轴，为靶向生物钟（如BMAL1）干预霉菌毒素毒性提供了新视角。

　　

1 引言

霉菌毒素是由产毒真菌通过特定生物合成途径产生的有毒次级代谢产物。在小麦中，最常见的霉菌毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEA），它们分别属于B型单端孢霉烯族毒素和雌激素样霉菌毒素，主要由镰刀菌属合成。其他重要的霉菌毒素包括来源于黄曲霉的黄曲霉毒素B1（AFB1）、来源于镰刀菌属的T-2毒素以及由曲霉属和青霉属产生的赭曲霉毒素A（OTA）。这些毒素通过食物链在动物和人体内积累，构成严重的健康风险，如肝毒性、肾毒性、基因毒性和免疫抑制作用，可能导致癌变或死亡。其毒性分子机制日益被阐明，例如，AFB1通过Toll样受体4（TLR4）/受体相互作用蛋白激酶1/3（RIPK1/3）信号通路以及Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）/核因子E2相关因子2（NRF2）通路诱导肝损伤；OTA通过激活细胞外信号调节激酶（ERK）/核因子-κB（NF-κB）通路导致肾小球损伤，并通过增加肠道中拟杆菌属丰度，增强脂多糖释放及后续TLR4-髓样分化因子88级联反应激活，经由肠-肝轴促进炎症；DON则通过改变绒毛结构和破坏黏膜屏障功能损害肠上皮完整性，其机制涉及激活ERK和p38/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，导致Claudin-4表达抑制以及Occludin和ZO-1的溶酶体介导的降解。

除了这些已确定的通路，新出现的证据表明，霉菌毒素还可能通过扰乱内源性昼夜节律计时系统（一个基本的生理调节器）来发挥毒性作用。一方面，真菌生物钟精确调控毒素合成（如OTA聚酮合酶基因的节律性表达）和宿主感染的昼夜节律（如尖孢镰刀菌通过转录因子FoZafA/FoCzf1协调毒力序列）。另一方面，霉菌毒素（如DON和ZEA）可以直接干扰昼夜节律核心基因，从而引发炎症级联反应和生殖内分泌紊乱。更值得注意的是，昼夜节律紊乱会进一步与氧化应激和免疫抑制形成恶性循环，从而可能放大毒素的多器官损伤效应。

本综述将系统探讨真菌昼夜节律对毒素产生和宿主感染的时间调控，详述霉菌毒素（如DON和ZEA）破坏核心时钟基因表达的分子途径，并研究涉及昼夜节律紊乱、氧化应激和免疫抑制的复杂反馈回路，最终阐明靶向昼夜节律作为潜在治疗策略以减轻霉菌毒素诱导毒性的潜在价值和应用。

2 真菌昼夜节律对毒素产生和毒力的调控

要理解霉菌毒素如何扰乱昼夜节律，首先必须了解昼夜节律的分子基础。昼夜节律构成一个内源性计时系统，使生物体能够使生理过程与每日光暗周期同步，维持一致的24小时周期性。昼夜节律系统通过由相互连接的转录和翻译反馈机制组成的分子钟运作。在光相期间，昼夜运动输出周期蛋白（CLOCK）和脑和肌肉Arnt样蛋白1（BMAL1）转录因子形成异源二聚体，结合E-box元件，启动周期蛋白（PER1-3）和隐花色素（CRY1/2）基因的转录。PER和CRY蛋白在细胞质中积累，随后转运到细胞核，在那里抑制CLOCK-BMAL1驱动的转录。该调节系统的改变与代谢、炎症、氧化应激和免疫病理相关。

真菌昼夜节律已被证明调控孢子发育和释放的每日时间。例如，频率基因被认为是调控和维持粗糙脉孢菌真菌昼夜节律的关键组成部分。现有证据表明，真菌昼夜节律对产霉菌毒素真菌的调控已在少数物种中得到证实，例如尖孢镰刀菌。尖孢镰刀菌是一种植物病原真菌，其内源性真菌昼夜节律钟通过调节锌胁迫反应和次级代谢来调控其毒力。尖孢镰刀菌表现出宿主侵染的每日波动，这由其内在真菌昼夜节律驱动。具体而言，转录因子FoZafA调节对缺锌环境的适应，而转录因子FoCzf1控制镰刀菌酸的生物合成。这些发现表明尖孢镰刀菌中的真菌昼夜节律协调了致病性相关基因表达的时间控制。这项工作强调了内源性真菌昼夜节律在调控尖孢镰刀菌的致病发育和宿主穿透能力方面起着关键作用。此外，如果生物合成基因位于昼夜节律调节因子的下游，毒素水平可以以昼夜节律方式振荡。OTA聚酮合酶基因（OTA生物合成途径的核心组成部分）的表达在光暗周期下表现出节律性变化。而且，OTA的产生根据真菌是保持在持续黑暗还是持续光照下而波动。然而，这些机制在广泛的产霉菌毒素真菌中的普适性需要进一步研究。

3 霉菌毒素对昼夜节律基因表达的破坏性影响

真菌利用其昼夜节律来优化宿主入侵和毒素生产。然而，一旦进入宿主体内，霉菌毒素可以直接干扰宿主昼夜节律钟，后者调节生理防御机制。越来越多的证据表明，霉菌毒素破坏宿主昼夜节律功能，可能加速疾病进展。例如，在DON暴露下，关键的昼夜节律基因显著下调，表明宿主昼夜节律受到干扰。在Hepa 1-6细胞（小鼠）中，RT-qPCR分析显示，CLOCK、REV-ERBα、REV-ERBβ、CRY1和CRY2转录本在DON暴露后均下调。在此体外模型中，DON暴露下，BMAL1水平在所有检测组中均显著降低，其中在BMAL1^shRNA + DON组中观察到最显著的下降。进一步的小鼠体内结果显示，BMAL1上调减少了炎症介质，而DON暴露显著升高了血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平。潜在机制涉及DON诱导的促炎细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α，最终抑制核心时钟基因的转录。这些发现将BMAL1确定为一个核心昼夜节律调节因子，能够抑制急性DON暴露引发的炎症，表明其作为未来研究中减轻DON相关毒性的分子靶点的潜力。鉴于DON和T-2毒素（分别为B型和A型单端孢霉烯族毒素）在结构上的相似性，T-2毒素也可能破坏宿主昼夜节律和免疫功能，这一假说值得进一步研究。

类似地，ZEA暴露显著破坏了TM3和原代Leydig细胞中的宿主昼夜节律基因表达。ZEA降低了TM3细胞中BMAL1、DBP、PER2和NR1D1的mRNA水平。在Leydig细胞中，ZEA暴露后BMAL1和DBP的表达水平显著降低。尽管PER2和NR1D1的表达并非在所有时间点都持续下降，但Cosinor分析表明在ZEA处理下节律性丧失。此外，暴露于ZEA 24或48小时后，睾酮分泌显著减少。ZEA的宿主昼夜节律和类固醇生成效应在小鼠睾丸中得到了进一步验证，证实了在原代Leydig细胞和TM3细胞中观察到的类似改变。这些发现表明，ZEA似乎通过改变Leydig细胞中的宿主昼夜节律来干扰睾酮生产。然而，潜在的分子途径仍未明确。ZEA改变时钟基因转录的精确机制，以及是否由ROS、细胞因子或受体信号传导介导，尚待完全阐明。未来的工作可能涉及抑制关键的昼夜节律调节因子，以评估毒素暴露下的生殖功能变化。

4 昼夜节律紊乱驱动的氧化应激–免疫抑制

霉菌毒素对昼夜节律的破坏并非孤立效应，它引发了一系列有害的下游后果，主要包括氧化应激和免疫功能的失调。尽管氧化应激诱导的昼夜节律紊乱日益受到关注，但氧化应激对昼夜节律基因表达的影响及其潜在机制仍知之甚少。升高的ROS水平诱导了CLOCK1、BMAL1、PER3和PER1转录丰度的振荡性抑制。zeste同源物2（EZH2）的破坏导致核心昼夜节律基因表达水平的周期性下降。JTK-Cycle分析证实EZH2缺陷显著降低了这些基因的振幅。EZH2过表达显著增强了BMAL1和PER2的昼夜节律表达，而氧化应激通过缩短周期长度、提高振幅和诱导相位改变来抵消这种效应。这些结果有力地支持了EZH2作为ROS依赖性昼夜节律控制的核心调节因子的作用。此外，EZH2以剂量依赖的方式促进CLOCK1-BMAL1驱动的PER1启动子活性，而氧化应激抑制了这种效应。因此，氧化应激通过ROS改变昼夜节律，ROS调节增强子EZH2与CLOCK-BMAL1复合物之间的相互作用。相比之下，另一项研究报告称，氧化应激提高了NIH3T3细胞中昼夜节律调节因子CLOCK、BMAL1、PER1/2和CRY1/2的蛋白水平。它还通过调节RORα、REV-ERBα和REV-ERBβ改变了BMAL1-荧光素酶的振荡活性。随后的分析表明，氧化应激通过信号转导和转录激活因子3（STAT3）-REV-ERBα/β-过氧化物还原蛋白2信号轴影响昼夜节律计时。转录抑制和蛋白水平升高之间的明显差异可能源于多层次的转录后调控。这可以解释为诸如转录后补偿等生物学机制，即细胞可能增强时钟蛋白的翻译或稳定性。此外，具体结果可能取决于关键的实验变量，包括不同的氧化应激水平/时机，急性与慢性暴露可能触发不同的细胞反应。因此，这些相反的发现可能代表了昼夜节律钟对氧化应激的适应性和适应不良反应的不同方面。

这种昼夜节律紊乱反过来又显著导致免疫抑制。昼夜节律调节因子BMAL1在抑制活化巨噬细胞和单核细胞中程序性死亡配体1（PD-L1）的表达方面起着至关重要的作用。当BMAL1缺失时，丙酮酸激酶M2（PKM2）水平升高，导致乳酸产生增加，从而通过STAT1依赖性机制促进PD-L1的诱导。通过限制PD-L1表达，BMAL1有助于保持T细胞功能。这些发现突出了昼夜节律紊乱与免疫抑制之间的关系。值得注意的是，昼夜节律的破坏也会诱导氧化应激，加剧免疫抑制。具体而言，BMAL1的缺失（这会扰乱昼夜节律）导致ROS水平升高和PD-L1的上调。此外，昼夜节律的损害与中性粒细胞和单核细胞群体的扩增相关，同时降低了肿瘤游离组织和肿瘤组织中CD8⁺ T细胞的丰度。这些观察结果证实，昼夜节律紊乱在调节免疫抑制中起着关键作用。昼夜节律紊乱诱导氧化应激并升高ROS水平，从而促进PD-L1上调并导致免疫抑制。此外，研究结果表明氧化应激和昼夜节律之间存在双向关系，其中每一方都可能加剧另一方。

5 结论与展望

霉菌毒素如DON和ZEA可证明地破坏核心昼夜节律钟基因（如BMAL1和CLOCK）的表达和功能，导致分子和功能的昼夜节律紊乱。然而，关于昼夜节律紊乱如何导致霉菌毒素诱导的毒性谱（包括代谢失调、炎症、氧化应激和免疫功能障碍）的具体机制途径，当前知识仍然有限。连接昼夜节律紊乱与霉菌毒素毒性（代谢紊乱、炎症、氧化应激和免疫功能障碍）的精确分子途径仍有待探索。各种霉菌毒素与昼夜节律紊乱的剂量反应和时间过程关系尚不清楚。确定这些效应是短暂和可逆的，还是会导致昼夜节律系统的长期适应不良（即使在暴露停止后），至关重要。昼夜节律紊乱与氧化应激之间复杂的双向关系，将两者定位为霉菌毒素诱导免疫毒性的核心介质。未来的研究可以采用多组学方法和条件性敲除模型来剖析这种串扰，并确定哪个节点（例如，EZH2和BMAL1-PKM2-PD-L1）是最有效的干预杠杆。鉴于T-2毒素与DON在结构上的相似性，其破坏昼夜节律及后续免疫调节的潜力值得立即研究。迫切需要进一步的研究来阐明昼夜节律的确切作用，并评估其作为减轻霉菌毒素多方面毒性的新型干预靶点的潜力。