吸入式重组人IL-15联合手术及化疗治疗犬骨肉瘤的II期临床试验：一项揭示免疫疗法时序重要性的意外发现

本刊推荐一项由美国国家癌症研究所比较肿瘤试验联盟（COTC）主导的多中心II期临床试验（NCI-COTC030）。该研究意外发现，在犬肢体骨肉瘤（OSA）标准治疗（截肢术+卡铂化疗）基础上，于术后、化疗前加入吸入式重组人IL-15（rhIL-15）辅助治疗，反而导致患犬的无病生存期（DFI）和总生存期（OS）显著劣于历史对照组。研究通过免疫相关分析揭示了手术和化疗对免疫功能的显著影响，强调了在多模式治疗中免疫疗法时序安排的至关重要性，对新型免疫治疗策略的开发具有重要警示意义。

　　

背景

近年来，癌症免疫疗法取得了突破性进展，例如免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞，充分展示了免疫疗法的潜力。然而，仅有部分患者对治疗产生应答。骨肉瘤（OSA）是一种难以治疗的癌症，在过去40年中，犬和人类的OSA治疗效果均停滞不前。尽管在其他癌症中取得了巨大成功，当前的免疫疗法在OSA中显示出极低的疗效。犬OSA与人类OSA具有显著的相似性，其自然病程、疾病生物学和对治疗的反应都非常相似。因此，犬类临床试验成为连接基础研究与人类临床试验的关键桥梁。

我们此前的研究表明，吸入式重组人IL-15（rhIL-15）在患有转移性OSA和黑色素瘤的犬中具有抗肿瘤活性。IL-15是一种关键的免疫刺激细胞因子，对自然杀伤细胞（NK细胞）和记忆T细胞的发育、增殖和活化至关重要。基于此，我们假设在原发性OSA犬中，在标准截肢术和辅助卡铂化疗的基础上加入吸入式rhIL-15，能够通过增强内源性NK细胞功能，有效清除微转移病灶，从而改善预后。微转移灶是指在手术时已从原发肿瘤扩散但通过诊断性检查无法检测到的播散性癌细胞。

材料与方法

本研究是一项在美国国家癌症研究所比较肿瘤试验联盟（COTC）框架下进行的多中心、单臂II期临床试验（COTC030）。研究纳入了经确诊为肢体OSA、无宏观转移证据且未接受过 prior treatment 的犬只。主要目的是确定在术后15周时保持无病状态的犬只比例。历史对照组数据来自先前一项仅接受标准护理（SOC，即截肢术+卡铂化疗）的COTC试验（COTC022）。

治疗方案如下：犬只在入组后10天内接受标准截肢术。术后3天内开始吸入rhIL-15治疗（50 μg，每日两次），持续14天。在术后16至28天，开始辅助卡铂化疗（300 mg/m²，静脉注射）。研究计划招募40只犬，以期将术后15周的转移失败率从历史水平的40%降低至20%。

研究还前瞻性地收集了相关生物学样本，包括外周血单个核细胞（PBMC）和原发肿瘤标本，用于进行免疫 translational 分析，例如细胞毒性测定、细胞因子多重分析和单细胞RNA测序（scRNA-seq），以探索治疗的免疫学效应。

结果

患者 demographics 与治疗完成情况

共招募42只犬，其中37只符合纳入标准，构成意向治疗（ITT）人群。其年龄、体重等特征与历史对照组无显著差异。36只犬开始了吸入IL-15治疗，33只完成了两周的疗程。33只犬开始了卡铂化疗，构成符合方案集（PP）人群。

临床结果：意外的生存劣势

与预期相反，接受吸入rhIL-15辅助治疗的犬只，其临床结果显著差于历史对照组。

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  在意向治疗人群中，术后15周时仅有53%的犬保持无病状态（历史对照为69%），中位无病生存期（DFI）为109天（历史对照为180天），差异具有统计学意义（P = 0.033）。
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  中位总生存期（OS）为224天（历史对照为282天），差异也具有统计学意义（P = 0.003）。
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  在符合方案集人群中的分析得到了相似的结果。因此，试验因无效而提前终止。

安全性

最常见的 adverse events（AEs）与手术（如肌酸激酶CK升高、切口血清肿）和化疗（如中性粒细胞减少症、血小板减少症）相关。未发现归因于IL-15治疗的AEs。

肿瘤微环境（TME）分析

对原发肿瘤的转录组分析重现了此前定义的三种OSA肿瘤微环境亚型：免疫富集型（IE）、免疫富集细胞外基质型（IE-ECM）和免疫荒漠型（ID）。在这些亚型之间，未观察到DFI的显著差异，这可能与样本量有限有关。值得注意的是，IL-15受体亚基（IL15RA, IL2RB, IL2RG）的表达量在IE肿瘤中最高，其次是IE-ECM和ID肿瘤。

PBMC细胞毒性动态变化

对PBMC的细胞毒性分析显示，治疗过程对免疫功能产生了显著影响。细胞毒性水平在基线时最高，术后第一周出现显著下降，吸入IL-15后（第3周）有适度回升，但在化疗后（第6周）再次出现显著下降。从治疗开始到结束，细胞毒性总体显著降低（-18.2 ± 16.1%, P<0.001）。然而，个体犬只表现出不同的反应模式。那些PBMC细胞毒性从基线到最大观察值呈现正向 fold change 的犬只，其生存期显著更长（P = 0.004, r=0.62）。

血浆细胞因子分析

血浆中关键细胞因子（如IL-6, IL-8, IL-10）的浓度在不同犬只和不同时间点间存在显著异质性，在15周时无病犬与发生转移的犬之间未发现显著差异。当按TME亚型分层分析时，ID型犬的IL-6和IL-10水平在各时间点往往最高，这与这些细胞因子的免疫抑制作用是相符的。

PBMC单细胞测序分析

对一只短DFI犬和一只长DFI犬的纵向PBMC样本进行scRNA-seq分析，揭示了免疫细胞组成和基因表达谱的差异。与健康对照相比，DFI犬的T细胞比例减少。在短DFI犬与长DFI犬比较中，短DFI犬的NK细胞比例明显降低，而中性粒细胞和单核细胞比例增加。TreeCorTreat 分析表明，T细胞、NK细胞、B细胞和单核细胞的整体基因表达谱与DFI显著相关。短DFI犬和长DFI犬在所有细胞类型中，尤其是在T细胞簇中，表现出独特的基因表达模式，提示可能存在预测预后的基因特征。

讨论

本研究的结果出乎意料，与在患有肉眼可见肺转移瘤的犬中观察到的吸入rhIL-15单药的抗肿瘤活性形成了鲜明对比。这表明在微观疾病环境下，免疫疗法的时机和与其它治疗模式的相互作用可能产生截然不同的后果。

对于这一意外结果，有几种可能的解释：

1. 1.
   术后免疫抑制环境：手术创伤会诱发炎症和免疫抑制状态，可能涉及髓源性抑制细胞（MDSCs）等抑制性细胞的扩增。这些细胞若表达IL-15受体，可能会“虹吸”IL-15，反而增强其免疫抑制功能，或限制IL-15对NK细胞和T细胞的刺激作用。
2. 2.
   免疫疗法与化疗的相互作用：IL-15诱导的淋巴细胞增殖可能使这些细胞对后续化疗（卡铂）更敏感，导致激活诱导的细胞死亡，从而削弱了机体对循环中或肺内播散肿瘤细胞的免疫监视能力。
3. 3.
   唤醒休眠肿瘤细胞：手术引起的炎症反应，叠加IL-15的免疫刺激，有可能打破免疫系统控制的肿瘤休眠状态，反而促进了微转移灶的生长。

本研究强调了在多模式癌症治疗中，免疫疗法时机安排的关键重要性。近期在人类黑色素瘤中的研究也提示，新辅助免疫疗法可能比辅助免疫疗法更有效，部分原因在于手术前肿瘤抗原的存在能更有效地激发抗肿瘤免疫应答。

结论

总之，这项II期临床试验表明，在犬骨肉瘤的标准治疗（截肢术和卡铂化疗）中，于术后、化疗前加入吸入式rhIL-15辅助治疗，与显著更差的临床结果相关。这一意外发现警示我们，免疫刺激剂在特定治疗时序下可能产生有害影响。深入的免疫相关分析证实了手术和化疗对免疫功能的显著影响，并揭示了与生存相关的免疫生物标志物。这些发现对于设计包含手术、化疗和免疫疗法的多模式治疗策略具有重要的借鉴意义，并凸显了自发犬肿瘤模型在评估新型免疫疗法风险和收益方面的转化价值。