Semaphorin 3A和3F促进TIE2突变型静脉畸形的管腔扩张

《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》：Semaphorin 3A and 3F Promote Lumen Expansion in TIE2-Mutated Venous Malformation

研究通过体内外模型发现，TIE2突变型内皮细胞（EC）通过过度表达Sema3A和Sema3F排斥野生型EC，导致静脉畸形（VM）血管腔异常扩大。敲除Sema3A/F可逆转排斥效应，促进野生型EC迁移和管腔形成，缩小病变体积。结论表明TIE2突变EC的克隆扩增及分泌信号分子是VM扩大的关键机制。

　　静脉畸形（VMs）是一种血管发育异常，其特征是异常扩大且功能失调的静脉。这种病症在临床上表现为蓝色、可压缩的病变，属于慢流血管畸形，已被国际血管异常研究学会分类。VMs的患病率估计为每10,000名新生儿中有1至2例，男女发病率相等。随着儿童成长，VMs会持续扩展，可能导致畸形、慢性疼痛、重要器官受阻、出血、血栓形成以及肺栓塞风险增加。目前的标准治疗通常是非靶向且侵入性的，包括硬化疗法和减压手术，但由于VM容易复发，患者需要终身接受多次干预。目前尚无美国食品药品监督管理局批准的VM医疗疗法，尽管临床试验和预临床研究已表明，mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）抑制剂雷帕霉素可改善症状并抑制VM病变扩展，但其并不能显著减少病变体积。

研究发现，TEK基因的获得性功能增强突变，该基因编码TIE2（内皮酪氨酸激酶受体），与大多数（约56%）散发性和遗传性皮肤和黏膜VM相关。此外，PIK3CA（I类磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基）的体细胞功能增强突变也与少量VM病例相关。TIE2在血管发育中起关键作用，调节血管生成的促进和血管静止状态的维持。功能增强的TIE2和PIK3CA信号可增加下游促血管生成通路的磷酸化，包括PI3K/AKT通路，从而促进内皮细胞（ECs）的增殖和存活。在VM患者中，最常见的TIE2突变是TIE2 p.L914F（TIE2-L914F）非同义变异。

尽管已知特定的TIE2突变和增加的AKT信号与VM的形成和生长有关，但尚不清楚突变EC或前体细胞如何驱动血管腔的异常扩大。该领域的一个重要问题是，突变EC是否通过细胞间通信招募邻近的野生型（WT）EC进入畸形血管，或者它们是否通过克隆扩增实现这一效应。Semaphorins（Semas）是一类指导分子，它们在生理和病理血管生成及EC迁移中调节细胞间通信。Semas可通过NRP（神经节苷脂）和plexin受体提供排斥和吸引信号。Semaphorin 3A和Semaphorin 3F是分泌型指导分子，允许旁分泌通信。这些Semas在血管生成的尖端形成中抑制丝状伪足的形成，并防止EC整合素介导的粘附和血管重塑。尽管失调的Sema类3表达水平与病理血管生成、年龄相关的的心脏功能障碍以及肿瘤进展相关，但Sema3A和Sema3F在VM发病机制中的作用尚未明确。

本研究旨在识别导致异常扩大VM血管的细胞和分子机制。我们假设Sema3A和Sema3F的过表达通过调节TIE2-L914F突变EC与WT EC之间的细胞间通信，从而驱动VM病变的异常扩大。为此，我们使用shRNA介导的Sema3A或Sema3F及它们的NRP受体NRP1或NRP2的下调，并评估WT EC在细胞对抗实验中的迁移情况，结合时间推移成像进行分析。随后，我们分析了Sema3A和Sema3F在3D体外细胞竞争实验和VM异种移植模型中的作用，这些模型通过将TIE2-L914F突变EC与WT EC混合获得。

在VM异种移植模型中，我们发现异常扩大的血管几乎完全由突变EC构成，而WT EC的贡献非常有限。功能性分析表明，TIE2突变EC通过抑制WT EC的芽生而对WT EC具有竞争优势。与这些发现一致，TIE2突变EC通过过表达Sema3A和Sema3F促进WT EC的排斥。Sema3A和Sema3F的shRNA沉默可逆转这种化学排斥表型，并恢复WT EC的迁移、芽生和腔形成能力。此外，Sema3A或Sema3F在TIE2突变EC中的敲低在体内可恢复正常血管大小。

我们的结果表明，WT EC并未被招募到异常扩大的静脉中，这表明VM的发病机制是由TIE2突变EC的克隆扩增驱动的。从机制上讲，我们发现Sema3A和Sema3F在TIE2突变EC中过表达，并在VM血管腔异常扩大中起关键作用。通过RNA测序和shRNA介导的基因敲低，我们验证了这些发现，并确认了Sema3A和Sema3F在TIE2突变EC中的表达水平。此外，我们还通过RNA原位杂交技术在患者组织切片中观察到Sema3A和Sema3F在病变血管中的显著高表达，而这些血管的非病变部分则表达较低。这些结果支持了Sema3A和Sema3F在VM病理过程中的关键作用。

进一步的研究表明，Sema3A和Sema3F的敲低不仅恢复了TIE2突变EC与WT EC之间的细胞通信，还显著减少了VM血管病变的大小。这表明，Sema3A和Sema3F的抑制可能成为治疗VM的新策略。此外，我们还探讨了Sema3A和Sema3F在TIE2突变EC中的细胞自主效应。通过将Sema3A或Sema3F敲低的TIE2突变EC单独注射到裸鼠体内，我们发现这些病变的血管化程度显著降低，体积也明显减小，这进一步支持了Sema3A和Sema3F在TIE2突变EC中的关键作用。

本研究的发现对于理解VM的发病机制具有重要意义，并为开发更有效且非侵入性的治疗方法提供了新思路。虽然目前的治疗方法存在局限性，但我们的研究结果表明，针对Sema3A和Sema3F的干预可能有助于减缓或阻止VM病变的进展。此外，我们还指出，VM病变的大小和形态可能与WT EC的招募有关，而这种招募并非由病变的大小决定，而是由Sema3A和Sema3F的表达水平影响。因此，未来的治疗方法可能需要考虑如何调控这些分子，以恢复正常的血管结构并减少病变负担。

本研究的局限性在于，我们主要关注了TIE2-L914F突变EC的作用，而未完全探讨其他TIE2或PIK3CA突变是否也会导致类似的机制。然而，已有研究表明，PIK3CA突变同样会导致血管异常扩张，这可能表明Sema3A和Sema3F的过表达是多种VM突变的共同病理机制。此外，我们使用的模型和实验方法虽然提供了有价值的见解，但仍需进一步研究以确认这些发现是否适用于其他类型的VM病变。未来的研究可以利用转基因或敲入突变TIE2小鼠模型，更准确地模拟VM发病过程的不同阶段，从而更深入地理解突变EC在血管生成和扩张中的作用。这些模型将有助于追踪突变和WT细胞在血管形成和扩张过程中的动态变化，进一步验证TIE2突变EC的克隆扩增是否是VM的主要驱动因素。