ZDHHC2介导的USP19棕榈酰化通过调控ACSL4降解抑制铁死亡进而导致前列腺癌恩杂鲁胺耐药

《Advanced Science》：ZDHHC2-Dependent Palmitoylation Dictates Ferroptosis and Castration Sensitivity in Prostate Cancer via Controlling ACSL4 Degradation and Lipid Peroxidation

本研究揭示了去势抵抗性前列腺癌（CRPC）中恩杂鲁胺耐药的新机制。研究发现，恩杂鲁胺通过FOXA1/CXXC5/TET2转录复合体上调棕榈酰转移酶ZDHHC2的表达。ZDHHC2催化去泛素化酶USP19发生S-棕榈酰化，削弱其与脂质代谢关键酶ACSL4的结合，从而促进ACSL4的泛素-蛋白酶体降解，抑制脂质过氧化物生成和铁死亡（Ferroptosis），最终导致耐药。研究团队进一步合成了ZDHHC2特异性小分子抑制剂TTZ1，在细胞系和患者来源异种移植（PDX）模型中均能恢复ACSL4蛋白水平、重新激活铁死亡并逆转恩杂鲁胺耐药。该研究不仅阐明了棕榈酰化修饰通过调控ACSL4稳定性影响铁死亡的新通路（ZDHHC2-USP19-ACSL4轴），也为克服晚期前列腺癌耐药提供了新的潜在治疗靶点。

　　

引言

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，其进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是临床治疗的主要挑战。雄激素受体（AR）信号通路的重激活被认为是CRPC的主要驱动因素。恩杂鲁胺等新一代AR信号抑制剂虽能抑制AR信号，但耐药性问题日益突出。脂质生物合成和代谢相关生物学过程调节前列腺癌的进展和恩杂鲁胺耐药。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的、由磷脂过氧化驱动的细胞死亡形式，在癌症进展和治疗耐药中起关键作用。目前研究表明，S-棕榈酰化是脂质过氧化物清除途径的关键调节因子，例如ZDHHC20和ZDHHC8介导的GPX4棕榈酰化可抑制铁死亡。然而，棕榈酰化修饰是否以及如何调节脂质过氧化物的生成途径，进而影响铁死亡和恩杂鲁胺耐药，尚不清楚。

ZDHHC2促进CRPC细胞在恩杂鲁胺处理后的存活

为了探究恩杂鲁胺耐药的机制，研究人员对恩杂鲁胺敏感和耐药的前列腺癌患者样本进行了多组学分析（蛋白质组学、代谢组学）。蛋白质组学分析显示，差异表达蛋白在脂质代谢通路中富集。脂质代谢组学分析进一步揭示，耐药组和敏感组之间存在显著的鞘磷脂代谢差异，而其他磷脂类型无差异。值得注意的是，鞘磷脂合成的初始代谢物——棕榈酸水平在恩杂鲁胺耐药患者样本和细胞系中均显著升高。棕榈酸处理降低了细胞对恩杂鲁胺的敏感性。作为蛋白质S-棕榈酰化的直接供体，改变的棕榈酸水平可能影响蛋白质棕榈酰化状态。棕榈酰蛋白质组学分析显示，耐药组和敏感组之间的棕榈酰化修饰模式存在显著差异，差异棕榈酰化蛋白在癌症、铁死亡、细胞生长和脂肪酸氧化等通路中富集。使用棕榈酰化抑制剂2-BP处理可显著增强恩杂鲁胺的敏感性。通过对转录组数据的分析，发现棕榈酰转移酶ZDHHC2在恩杂鲁胺耐药组中表达上调最为显著。在耐药细胞系中敲低ZDHHC2可部分逆转恩杂鲁胺耐药，而过表达ZDHHC2则促进耐药。重要的是，酶活死亡突变体（ZDHHC2 C129A）无法赋予耐药性，表明ZDHHC2介导的耐药性严格依赖于其酶活性。在自发前列腺癌小鼠模型中，ZDHHC2敲除显著限制了肿瘤生长并增强了恩杂鲁胺敏感性。此外，研究人员合成了ZDHHC2特异性棕榈酰化抑制剂TTZ1，TTZ1处理能显著增强恩杂鲁胺在敏感和耐药CRPC细胞系以及耐药PDX模型中的疗效，且在ZDHHC2敲除后，TTZ1不再影响恩杂鲁胺敏感性，表明TTZ1特异性靶向ZDHHC2。

ZDHHC2在恩杂鲁胺耐药CRPC细胞中被FOXA1/CXXC5/TET2复合体转录上调

尽管观察到ZDHHC2在恩杂鲁胺耐药组中显著上调，但其机制尚不清楚。研究人员通过筛选发现，ZDHHC2的转录调控不同于经典的AR模式。在恩杂鲁胺耐药细胞中，FOXA1在ZDHHC2启动子区域的占据率更高。虽然AR敲低可部分降低ZDHHC2表达，但其调控不依赖于雄激素。进一步研究发现，FOXA1与CXXC5、TET2形成复合体调控ZDHHC2表达。敲低CXXC5或TET2均显著降低ZDHHC2表达，且CXXC5和TET2在耐药细胞中于ZDHHC2启动子区域的占据率也更高。敲低FOXA1显著降低ZDHHC2表达，而过表达FOXA1则增加其表达。敲低CXXC5或TET2会显著降低FOXA1在ZDHHC2启动子上的占据，表明FOXA1/CXXC5/TET2复合体的形成。回补实验证明，TET2与CXXC5的结合以及TET2本身（不依赖其催化活性）对于ZDHHC2的表达调控至关重要。此外，敲低CXXC5、TET2或FOXA1对ZDHHC2启动子区域H3K27ac水平的下调作用强于AR敲低。这些结果表明，恩杂鲁胺耐药CRPC细胞中ZDHHC2的过表达是由FOXA1、TET2和CXXC5组成的复合体介导的。

ZDHHC2通过抑制脂质过氧化物产生和铁死亡促进恩杂鲁胺耐药

为了阐明ZDHHC2促进耐药的机制，研究人员对对照和ZDHHC2敲低的细胞进行了多组学分析。蛋白质组学分析表明，ZDHHC2参与铁死亡和脂质代谢，并显著下调铁死亡关键驱动因子ACSL4的表达。脂质组学分析显示ZDHHC2敲低显著改变了前列腺癌细胞的脂质代谢物组成。棕榈酰蛋白质组学分析证明ZDHHC2显著改变了参与脂质代谢和铁死亡通路多个蛋白的棕榈酰化状态。在恩杂鲁胺敏感细胞系中，恩杂鲁胺处理显著提高了脂质过氧化和丙二醛（MDA）水平，并减少了细胞数量，而在耐药细胞系中这些指标无显著变化，表明铁死亡抑制在耐药中的关键作用。ZDHHC2敲低显著增加了erastin（铁死亡诱导剂）处理下的脂质过氧化、脂质活性氧（ROS）和MDA水平，并减少了细胞数量，促进了铁死亡。相反，过表达野生型ZDHHC2（而非酶活死亡突变体）降低了脂质过氧化、脂质ROS和MDA水平，增加了细胞数量，并在erastin处理下维持了线粒体形态，表明ZDHHC2通过其棕榈酰化功能抑制铁死亡以维持CRPC细胞存活。TTZ1处理产生了与ZDHHC2敲低相似的效果，且该效应在ZDHHC2敲除后消失。在CDX模型中，铁死亡抑制剂liproxstatin-1（lip-1）可减弱恩杂鲁胺在敏感组中的肿瘤抑制作用，但在耐药组中此效应不显著，进一步证实了铁死亡在恩杂鲁胺疗效中的作用。此外，过表达FOXA1、CXXC5或TET2抑制铁死亡，而敲低则促进铁死亡，证明该非经典通路通过抑制铁死亡促进恩杂鲁胺耐药。

ZDHHC2通过USP19促进ACSL4的泛素-蛋白酶体降解

研究人员进一步探究ZDHHC2抑制铁死亡的机制。蛋白质组学显示ZDHHC2敲低后，ACSL4蛋白水平显著升高，但mRNA水平无变化，表明ZDHHC2通过改变蛋白稳定性调控ACSL4。前列腺癌组织芯片免疫组化显示ACSL4与ZDHHC2蛋白水平呈负相关。蛋白酶体抑制剂MG132可逆转ZDHHC2过表达引起的ACSL4降解，表明ZDHHC2以泛素依赖性方式调控ACSL4。通过棕榈酰蛋白质组学，研究人员发现USP19等泛素-蛋白酶体相关蛋白的棕榈酰化水平在ZDHHC2敲低后发生显著改变。敲低实验表明，只有USP19影响ACSL4蛋白水平而不影响mRNA水平。组织芯片显示ACSL4与USP19蛋白水平呈正相关。Co-IP、GST pull-down和邻近连接实验（PLA）均证实了USP19与ACSL4之间存在内源性相互作用和直接物理结合。过表达USP19增加了ACSL4蛋白水平并延长其半衰期，而敲低USP19则缩短其半衰期。ZDHHC2对ACSL4蛋白半衰期的影响则相反。过表达USP19降低了ACSL4的多聚泛素化，而敲低则增加其泛素化，且USP19特异性抑制ACSL4的K48连接泛素化，证实USP19是ACSL4的稳定去泛素化酶。

ZDHHC2介导USP19的棕榈酰化

研究人员探究ZDHHC2是否通过棕榈酰化USP19来调控ACSL4水平。棕榈酰化抑制剂2-BP和TTZ1均可逆转ZDHHC2过表达引起的ACSL4降解，且TTZ1的效应呈剂量依赖性，并在ZDHHC2敲除后消失。Co-IP、GST pull-down和PLA实验证实了ZDHHC2与USP19之间的内源性相互作用和直接结合。分子对接和GST pull-down分析表明USP19与ZDHHC2的C端区域结合。通过酰基-生物素交换（ABE）实验和Click-iT pull-down实验，证实了内源性和外源性USP19均发生棕榈酰化。利用CRISPR筛选建立的ZDHHC敲除细胞系证明，只有ZDHHC2敲除能显著废除USP19的棕榈酰化。过表达野生型ZDHHC2（而非酶活死亡突变体）可增加USP19的棕榈酰化水平。棕榈酰蛋白质组学分析发现USP19的第152位半胱氨酸（C152）是其棕榈酰化位点，该位点在不同物种中高度保守。将C152突变为丝氨酸（S）后，USP19的棕榈酰化水平显著降低。此外，ZDHHC2过表达无法逆转USP19 C152S突变体过表达引起的ACSL4蛋白升高。在耐药细胞系中引入USP19 C152S突变，可阻止USP19被ZDHHC2棕榈酰化，并导致ACSL4蛋白水平高于野生型。棕榈酸处理可升高USP19棕榈酰化并降低ACSL4蛋白水平，此效应在ZDHHC2敲除后消失。在耐药细胞系中，USP19和ACSL4的mRNA水平不变，但USP19棕榈酰化水平升高，ACSL4蛋白水平降低。

USP19的棕榈酰化削弱其与ACSL4的相互作用并通过抑制铁死亡促进恩杂鲁胺耐药

研究人员探讨了USP19棕榈酰化的功能影响。Co-IP实验表明，野生型ZDHHC2过表达显著减弱了ACSL4与USP19的相互作用，但不影响ACSL4与USP19 C152S突变体的结合。TTZ1处理增强了ACSL4与USP19的结合。在耐药细胞系中，ACSL4-USP19的相互作用弱于敏感细胞系。PLA实验显示ZDHHC2敲低显著增强了USP19与ACSL4的相互作用。这些结果表明，ZDHHC2介导的USP19 C152位点棕榈酰化削弱了其与ACSL4的结合，增加了ACSL4的泛素化程度，促进了其泛素-蛋白酶体降解。功能上，过表达野生型USP19和C152S突变体均能增加恩杂鲁胺敏感性，且C152S突变体比野生型对恩杂鲁胺更敏感。过表达USP19可逆转ZDHHC2过表达引起的恩杂鲁胺耐药。在铁死亡方面，过表达USP19增加了脂质过氧化、脂质ROS和MDA水平，减少了细胞数量，且USP19 C152S突变体诱导铁死亡的效果更强。引入USP19 C152S突变体的细胞系表现出更强的铁死亡指标（更高脂质过氧化、更高MDA、更低细胞数）。此外，敲低USP19或ACSL4均可逆转ZDHHC2敲低带来的促铁死亡效应（降低脂质过氧化、脂质ROS、MDA水平，增加细胞数）。线粒体形态观察显示，USP19过表达促进线粒体损伤，C152S突变体引起的损伤更严重，且ZDHHC2过表达仅能逆转野生型USP19引起的损伤，而不能逆转C152S突变体的影响。综上所述，ZDHHC2棕榈酰化去泛素化酶USP19，削弱USP19与ACSL4的结合，从而促进ACSL4的泛素-蛋白酶体降解。

讨论与总结

本研究揭示了CRPC中恩杂鲁胺耐药的一种新机制。研究发现，恩杂鲁胺通过激活FOXA1/CXXC5/TET2复合体途径上调ZDHHC2表达。ZDHHC2作为棕榈酰转移酶，催化USP19发生S-棕榈酰化，进而削弱USP19与ACSL4的结合，促进ACSL4通过泛素-蛋白酶体途径降解。ACSL4的降解抑制了脂质过氧化物生成和铁死亡，最终导致恩杂鲁胺耐药。研究团队合成的ZDHHC2特异性抑制剂TTZ1，能够恢复ACSL4水平、重新激活铁死亡，并在临床前模型中逆转恩杂鲁胺耐药。该研究首次揭示了棕榈酰化修饰通过调控ACSL4稳定性影响铁死亡脂质过氧化物生成通路的新机制（ZDHHC2-USP19-ACSL4轴），为克服晚期前列腺癌的耐药性提供了新的理论基础和潜在的靶向治疗策略。