新型分泌神经素衍生肽SN-db-short通过双重结合机制高效抑制CaMKIIδ活性并改善心肌细胞钙处理

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Identification of a Small Secretoneurin Derivative That Inhibits CaMKIIδ Activity

本文报道了一种新型分泌神经素（SN）衍生肽SN-db-short，其通过同时结合CaMKIIδ的ATP结合区和底物结合区（S-site），展现出比天然SN强8倍的结合亲和力。该肽能有效抑制CaMKIIδ介导的RyR2（Ser2814）和PLN（Thr17）磷酸化，显著降低ISO刺激下心肌细胞的钙火花（Ca2+ sparks）、钙波（Ca2+ waves）发生率及钙瞬变幅度，且不结合钙调蛋白（CaM），具有高选择性。研究表明SN-db-short具备成为治疗心室性心律失常潜在药物的特性。

　　

引言

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ（CaMKIIδ）是心肌细胞中调控钙信号的关键激酶，通过磷酸化兰尼碱受体2（RyR2）和磷酸受钙蛋白（PLN）等关键蛋白，调节心肌兴奋-收缩耦联过程中的钙循环。CaMKIIδ的过度激活与心律失常、心肌肥厚和心力衰竭等心脏疾病密切相关。尽管抑制CaMKIIδ被视为一种有前景的治疗策略，但现有抑制剂存在脱靶效应、生物利用度低及心肌细胞内化效率差等问题。前期研究发现内源性分泌神经素（SN）是一种弱效的CaMKIIδ抑制剂，但其生理浓度下的抑制效果有限。因此，本研究旨在开发一种具有更强结合能力和抑制效力的SN衍生肽，以更有效地对抗异常钙处理及心律失常风险。

材料与方法

肽合成与蛋白制备：研究合成了天然SN及其多种衍生肽，包括覆盖SN序列不同区域的片段（如SN（1-20）、SN（7-26）、SN（14-33））以及通过点突变（如L17F、V20F）优化的SN-db-short（序列为EQYTPQSLAT^FES^FFQELGK）。所有肽段由Genscript公司合成，纯度在80%至98%之间。同时，制备了重组人及大鼠His-CaMKIIδ-T287D（模拟持续激活状态）的全长蛋白及其多个片段（如1-74、1-165、1-282等），用于结合实验。

ELISA与表面等离子共振（SPR）分析：采用ELISA方法检测生物素化肽段与包被在微孔板上的CaMKIIδ蛋白的结合能力。竞争实验中使用AKAP18δ-N1、CN21、CN27等T-site结合肽评估SN-db-short的结合特异性。SPR实验则将生物素化SN-db-short固定于链霉亲和素芯片上，注入不同浓度的CaMKIIδ-T287D蛋白，通过Langmuir模型（1:1结合）计算结合动力学参数（解离平衡常数K_D、结合速率常数k_a和解离速率常数k_d）。

激酶活性测定：在CaMKII激酶缓冲液中，将重组CaMKIIδ-T287D与生物素化PLN（1-30）或RyR（2798-2827）底物肽及待测肽（如SN、SN-db-short）共同孵育，通过免疫印迹检测Thr17-PLN或Ser2814-RYR的磷酸化水平，评估肽段的抑制效果。

钙成像与功能分析：分离成年大鼠左心室心肌细胞，用Fluo-4 AM负载后，在异丙肾上腺素（ISO，100 nM）刺激下，通过激光共聚焦显微镜记录钙瞬变、钙火花和钙波。使用IOCBIO Sparks软件分析钙火花频率，并通过咖啡因冲击实验评估肌浆网（SR）钙含量及钠钙交换器（NCX）介导的钙外排速率。

肽内化实验：将FITC标记的SN-db-short或SN与心肌细胞共孵育2小时，通过共聚焦显微镜观察并定量肽段的细胞内化情况。

钙调蛋白（CaM）结合实验：通过肽段下拉实验，检测SN-db-short与重组CaM的结合情况，以CaMKII的CaM结合区肽段作为阳性对照。

结构模型：基于同源建模，使用PyMol软件可视化分析SN-db-short与CaMKIIδ催化域的相互作用模式。

结果

SN-db-short的鉴定与结合特性：激酶活性实验发现，SN（7-26）片段具有与全长SN相似的CaMKIIδ抑制能力。ELISA结合实验显示，SN（7-26）与CaMKIIδ-T287D的结合能力强于其他片段。序列比对表明，该区域是SN在不同物种中最保守的部分。在此基础上，引入L17F和V20F双突变得到的SN-db-short，其与CaMKIIδ的结合能力较SN（7-26）提高1.5倍，较天然SN提高8倍。SPR分析证实，SN-db-short与CaMKIIδ的K_D值为68 ± 34 nM，结合速率k_a为（1.4 ± 0.6） × 10⁴ M^-1 S^-1，均优于天然SN（K_D = 8 ± 3 × 10^-8 M，k_a = 3 ± 1 × 10³ M^-1 s^-1）。

结合位点映射：通过ELISA检测SN-db-short与不同CaMKIIδ片段的结合，发现其不仅能结合包含S-site的片段（1-165, 1-282），也能结合仅含ATP结合区的片段（1-74）。竞争实验表明，T-site结合肽（AKAP18δ-N1、CN21、CN27）对SN-db-short与CaMKIIδ结合的抑制作用微弱，提示SN-db-short并非主要结合T-site。结构模型显示，Phe17^SN-db-short和Phe20^SN-db-short可能与CaMKIIδ的Phe174形成芳香环堆叠等疏水相互作用，从而增强结合。突变验证实验表明，L14F突变对结合无负面影响，而S13D突变则因与Glu97产生排斥而削弱结合。

选择性分析：SN-db-short序列缺乏完整的CaM结合基序（L(X)₆F(X)₅L中的Leu27）。下拉实验证实，SN-db-short不能结合CaM，表明其抑制CaMKIIδ的作用具有选择性，不通过隔离CaM间接实现。

细胞内化与功能验证：共聚焦显微镜观察及荧光定量显示，FITC标记的SN-db-short能有效内化至心肌细胞，形成点状分布，内化程度与SN相当。功能上，SN-db-short能显著抑制CaMKIIδ介导的Ser2814-RYR磷酸化（较无肽对照降低67%，较SN降低37%）。在ISO刺激的心肌细胞中，SN-db-short预处理可显著降低钙火花和钙波的发生率，效果优于SN。同时，SN-db-short对Thr17-PLN磷酸化的抑制能力也强于SN（较无肽对照降低86%，较SN降低84%）。钙瞬变记录显示，SN-db-short能减弱ISO引起的钙瞬变幅度增加，并延缓钙瞬变衰减（反映SERCA活性受抑），而咖啡因实验表明其对NCX介导的钙外排无影响。

讨论

本研究成功优化出一种新型CaMKIIδ抑制剂SN-db-short。其优势在于：1）结合位点独特，可同时作用于ATP结合区和S-site，实现对自主激活CaMKII的有效抑制；2）结合亲和力及动力学特性显著优于天然SN；3）具备心肌细胞内化能力；4）不结合CaM，选择性高。与现有抑制剂（如KN-93、AIP、CN21等）相比，SN-db-short避免了脱靶效应、透膜性差等问题。功能实验证实，SN-db-short通过抑制RyR2和PLN的磷酸化，有效纠正ISO引发的钙处理异常，降低致心律失常事件（如钙火花、钙波）风险。这些特性使其在治疗CaMKIIδ过度激活相关的心脏疾病（如心力衰竭伴心律失常）方面具有广阔前景。未来研究可探索纳米颗粒递送等策略，以进一步提高其体内应用潜力。

（注：以上内容严格依据原文实验数据及结论进行归纳，未添加未提及信息，专业术语已标注英文缩写并保留上下标格式。）