谷氨酸棒杆菌代谢工程高效生产抗菌药物玫瑰黄素的研究

《Microbial Biotechnology》：Production of the Antimicrobial Roseoflavin With Genetically Engineered Corynebacterium glutamicum

本文系统阐述了利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为微生物细胞工厂，高效生产具有抗菌活性的核黄素类似物——玫瑰黄素（RoF）的创新策略。研究通过异源表达玫瑰黄素生物合成基因（rosAB）、黄素转运蛋白基因（ribM）及核黄素激酶基因（ribF），并优化培养条件（如补充硫胺素），最终工程菌株CgRose6在摇瓶培养中实现了17.4 mg/L的玫瑰黄素产量，为非天然宿主最高水平，为可持续生产新型抗菌药物提供了可行路径。

　　

引言

抗生素耐药性已成为21世纪重大的公共卫生问题，迫切需要开发新型抗菌剂。玫瑰黄素（Roseoflavin, RoF）是一种天然存在的核黄素（Riboflavin, RF）类似物，对多种革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和李斯特菌）表现出显著的抗菌活性。然而，其工业化生产目前依赖于化学合成，该过程成本高昂且涉及危险化合物。因此，开发可持续的生物合成方法至关重要。本研究旨在通过代谢工程改造工业微生物宿主谷氨酸棒杆菌，构建高效的玫瑰黄素生物合成平台。

材料与方法

研究所用菌株包括谷氨酸棒杆菌野生型ATCC 13032及其衍生的核黄素高产菌株CgRibo2，以及一系列携带不同基因组合的重组质粒的工程菌（如CgRose1至CgRose6）。主要培养在CGXII最小培养基中进行，以葡萄糖为碳源。通过分子克隆技术（如Gibson组装）构建表达载体，并利用电穿孔法转化谷氨酸棒杆菌。基因表达由Ptac启动子控制，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导。通过抗菌试验评估菌株对玫瑰黄素的耐受性，使用激酶活性测定试剂盒分析RibF酶的活性，并通过高效液相色谱法（HPLC）和分光光度法分别定量胞外核黄素和玫瑰黄素。

结果

核黄素过量生产与RibM转运蛋白表达可缓解玫瑰黄素的抗菌效应

研究表明，玫瑰黄素对谷氨酸棒杆菌野生型具有毒性。然而，在核黄素过量生产的菌株CgRibo2中，玫瑰黄素耐受性显著提高。此外，异源表达来自玫瑰黄素天然生产者达沃伦斯链霉菌（Streptomyces davaonensis）的黄素转运蛋白基因ribM，能进一步增强菌株的耐受性。ribM编码的蛋白参与核黄素的摄取和玫瑰黄素的外排，这是一种对抗玫瑰黄素毒性的保护机制。将ribM在CgRibo2中表达后，工程菌株CgRibo2(pVWEx1-ribM)即使在较高浓度玫瑰黄素存在下也能维持生长。这表明，建立玫瑰黄素生产菌株时，结合核黄素过量生产和ribM表达是有益的。

玫瑰黄素生物合成基因rosAB的诱导时机优化

将达沃伦斯链霉菌的玫瑰黄素生物合成基因rosA和rosB在CgRibo2中表达，构建了菌株CgRose1（含rosAB）和CgRose2（含rosAB-ribM）。研究发现，诱导异源基因表达的时机对菌体生长和玫瑰黄素产量有显著影响。在培养起始（T0）即诱导基因表达会导致菌体生长受损。相比之下，在指数生长中期（T6）进行诱导，能有效减轻玫瑰黄素的抗菌效应，特别是对于表达了ribM的CgRose2菌株，其生长与对照菌株相当。在T6诱导条件下，CgRose2菌株在培养22小时后产生了3.6 ± 0.4 mg/L的玫瑰黄素。令人意外的是，同时表达第三个基因rosC（编码AFP磷酸酶）的菌株CgRose3和CgRose4，其玫瑰黄素产量反而低于不表达rosC的菌株。这表明在测试条件下，rosC的表达并非必需，甚至可能产生负面影响，谷氨酸棒杆菌可能具有内源性磷酸酶可催化该步骤。

核黄素激酶RibF对玫瑰黄素生产的增强作用

玫瑰黄素的生物合成始于核黄素，由双功能酶核黄素激酶（RibF）将其磷酸化为FMN。研究评估了来自谷氨酸棒杆菌（RibF^Cg）和达沃伦斯链霉菌（RibF^Sda）的RibF酶。激酶活性测定显示，两种RibF均能磷酸化核黄素和玫瑰黄素，但RibF^Cg的活性更高。随后，构建了同时表达rosAB、ribM以及ribF^Cg（CgRose5）或ribF^Sda（CgRose6）的菌株。尽管过表达ribF基因导致菌株生长速率下降约一半，但玫瑰黄素产量显著提高。CgRose2菌株在24小时产RoF 4.6 ± 0.4 mg/L，而CgRose5和CgRose6在48小时分别产RoF 10.7 ± 0.5 mg/L和12.2 ± 0.5 mg/L。其中，表达RibF^Sda的CgRose6菌株产量最高，这可能与其较低的激酶活性减少了有毒磷酸化玫瑰黄素类似物（RoFMN/RoFAD）的积累有关。

硫胺素补充进一步提升玫瑰黄素产量

玫瑰黄素生物合成途径中的RosB酶以硫胺素（Thiamine）为辅酶，而RosA酶则以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体。研究测试了在培养基中补充硫胺素盐酸盐（0.5 g/L）和/或甲硫氨酸（0.5 g/L）对生产的影响。结果表明，补充甲硫氨酸对工程菌的生长和产物合成有负面影响。相反，补充硫胺素则对玫瑰黄素生产有积极促进作用。在含硫胺素的培养基中，CgRose2和CgRose6的玫瑰黄素产量分别提高了17%和24%。最终，CgRose6菌株在补充硫胺素的最小培养基中，经过48小时培养，玫瑰黄素产量达到17.4 ± 1.5 mg/L，体积产率为0.36 ± 0.03 mg/L·h。这是迄今为止非天然玫瑰黄素生产者在摇瓶培养中报道的最高产量。

讨论

谷氨酸棒杆菌因其对多种抗菌剂的耐受性以及成熟的遗传操作工具，成为生产抗菌分子的理想宿主。本研究成功地将玫瑰黄素生物合成途径导入谷氨酸棒杆菌。关键策略包括利用核黄素高产背景提供充足前体，表达ribM蛋白促进产物外排以减轻自身毒性，优化基因诱导时机（指数中期），以及过表达ribF基因增强前体流向玫瑰黄素合成途径。值得注意的是，rosC基因的负面效应提示途径中基因的表达水平和组合需要精细调控。硫胺素的补充直接促进了依赖该辅酶的RosB酶的活性，从而提高了产量。与天然生产者达沃伦斯链霉菌（产量12.2 mg/L）和重组 Komagataella phaffii（在生物反应器中产量129.6 mg/L，但培养时间长达312小时）相比，本研究获得的CgRose6菌株在短时间内达到了具有竞争力的产量和产率，证明了谷氨酸棒杆菌作为玫瑰黄素生产平台的巨大潜力。

结论

本研究通过代谢工程成功构建了能够高效生产抗菌化合物玫瑰黄素的谷氨酸棒杆菌工程菌。最终菌株CgRose6整合了核黄素过量生产、异源玫瑰黄素合成基因（rosAB）、黄素转运蛋白（ribM）及核黄素激酶（ribF）的过表达，并在补充硫胺素的优化培养基中，实现了摇瓶水平下17.4 mg/L的玫瑰黄素产量。该研究为玫瑰黄素的可持续生物制造提供了新的策略，并进一步巩固了谷氨酸棒杆菌作为重要微生物细胞工厂的地位。