甲基营养型 Bacillus methanolicus 中 MscS 作为 L-谷氨酸关键外排通道的鉴定及其工业应用潜力

《Microbial Biotechnology》：Identification of MscS as a Key L-Glutamate Exporter in Bacillus methanolicus

本文系统揭示了甲基营养菌 Bacillus methanolicus 中 MscS 作为 L-谷氨酸关键外排通道的作用。研究通过转录组学、生物信息学、结构预测和功能获得/缺失实验，证实了 MscS 在 L-谷氨酸外排中的核心地位，并阐明了其受膜脂质组成和脂肪酸代谢调控的“力来自脂质”的通道开启机制。该发现为利用 B. methanolicus 及其相关甲基营养菌进行可持续氨基酸生产提供了新的工程策略和理论基础。

　　

引言

适应环境变化（如低渗休克）的能力对细菌至关重要。小电导机械敏感性通道（MscS）在通道与其沟槽中的脂质相互作用时门控并释放溶质。大量使用膜指标的研究表明，机械敏感性通道经历构象变化，这些变化受到脂质组成及其在膜中特定位置的显著影响。最近一项研究表明，MscS 可以被去垢剂去脂化，并通过重新引入脂质而关闭，这表明脂质挤出触发了门控。这些通道作为有价值的工业产品的外排蛋白具有巨大潜力，导致了对工业生物技术主力菌株 Corynebacterium glutamicum 和 Escherichia coli 机械敏感性通道的广泛表征研究。此外，MscS 样通道共享一个核心结构，但其门控机制和导电特性基于大小和结构差异进行微调。因此，在其他显示出工业应用前景的生物体中探索类似的外排通道是值得的。

甲基营养菌宿主可以利用一碳（C1）化合物，如甲醇，作为其唯一的碳源和能量来源。甲醇因其丰富、低成本、可再生性以及与食品和饲料行业的非竞争性而成为一种有吸引力的第二代原料，因此天然甲基营养菌在生产各种高附加值化学品方面引起了越来越多的兴趣。其中，Bacillus methanolicus——一种革兰氏阳性、产孢甲基营养菌——已成为一种有前景的平台菌株。经过深入研究的 MGA3 菌株在基于甲醇的分批补料发酵中天然产生高水平的 TCA 循环衍生氨基酸 L-谷氨酸，滴度高达 60 g L^?1，并且已被工程化以生产 L-谷氨酸衍生物，如 γ-氨基丁酸。值得注意的是，B. methanolicus 也可以在糖醇甘露醇上生长，甘露醇是海藻生物量的关键组成部分，使得能够从富含甘露醇的褐藻提取物中生产尸胺。这些特性共同突出了该生物体在使用甲醇和海藻衍生碳源进行灵活、可持续生物过程方面的潜力。

虽然 MscS 通道在革兰氏阴性菌中得到了广泛研究，但它们在革兰氏阳性物种（特别是像 B. methanolicus 这样的甲基营养菌）中 L-谷氨酸外排的作用相对较少被表征。此外，由于上述原因，B. methanolicus 被认为是生物技术行业中一个有前景的宿主。了解其可持续生产高附加值化合物的代谢过程至关重要。例如，该菌中 L-谷氨酸的外排机制尚未阐明。L-谷氨酸是一种中等有效的相容性溶质，其在 B. methanolicus 中的细胞内浓度随着外部渗透压的增加而增加。有趣的是，大部分新合成的 L-谷氨酸从细胞中排泄出来。通过向 B. methanolicus 发酵培养基中添加表面活性剂，L-谷氨酸外排得到进一步增强。在这里，我们利用生物信息学、转录组学和生理学研究分析了 B. methanolicus 菌株 MGA3，以研究 L-谷氨酸外排的分子机制，这是优化 B. methanolicus 生物技术潜力的关键一步。我们的研究结果确定 MscS 是一个关键的 L-谷氨酸外排蛋白，并提供了对其作用模式的见解。

培养基诱导的甲醇基 L-谷氨酸生产

本研究旨在探索 B. methanolicus 中 L-谷氨酸的外排机制。为此，我们评估了 B. methanolicus 在两种不同培养基条件下的生长。第一种培养基（MVcM）是 B. methanolicus MGA3 生长常用的基本培养基，另一种培养基是专门为 L-谷氨酸生产优化的培养基（MVcMii）。在 MVcM 条件下，B. methanolicus 野生型菌株 MGA3 在摇瓶中产生 38 ± 2 mg/L L-谷氨酸，相当于 67 ± 3 mg/g CDW。相比之下，在 MVcMii 培养基中生长产生 333 ± 67 mg/g CDW 的 L-谷氨酸。L-谷氨酸生产滴度在 MVcMii 培养基中增加至 526 ± 100 mg/L，这代表了由于培养基组成改变而带来的约 14 倍的增强。尽管在两种培养基中实现了相似的生长速率，但在 MVcM 中培养的 MGA3 的生物量比在 MVcMii 中低约 2.8 倍。这种差异可归因于 MVcMii 组合物中存在的额外碳源（5 g/L 甘露醇）。

B. methanolicus 研究中，基于甲醇的 L-谷氨酸生产在 MVcM 中有所不同。我们在 MVcM 培养基下的烧瓶发酵中观察到的 L-谷氨酸滴度低于 Krog 等人在类似实验中报告的值（800 mg/L）。然而，我们的发现超过了 Frank 等人报告的 19 mg/g CDW，我们的研究显示约为 67 mg/g CDW。生长条件的微小差异可能导致了这种变化。虽然我们在培养过程中常规使用 10% 的工作体积（液体与烧瓶的比例），但 Krog 等人使用了 20%，而 Frank 等人则使用水浴来控制摇瓶的温度。然而，这种差异的根本原因需要进一步研究。对于 MVcMii，除了向培养基中添加甘露醇作为额外碳源并将氮源浓度加倍外，镁源（MgSO₄）的浓度比 MVcM 降低了 80%。确实，据报道，B. methanolicus 中的 L-谷氨酸生产通过生长培养基中的镁限制而增强。镁限制是 C. glutamicum 中 L-谷氨酸过量生产的经典触发因素。在存在 Mg²⁺ 的情况下，谷氨酸脱氢酶利用 NADPH 有效地同化铵，但在镁限制条件下，降低的酶活性限制了铵同化并将 α-酮戊二酸转向 L-谷氨酸合成。这突出了调节外部生理因素对 L-谷氨酸生产的积极影响。值得注意的是，B. methanolicus MGA3 在渗透压变化下表现出高达 10 倍的 L-谷氨酸外排增加。在细菌中，生长培养基中非离子乳化剂 Tween 80 的存在显著影响脂肪酸谱；它可以增加饱和脂肪酸并减少不饱和脂肪酸，导致细菌细胞膜的组成和功能发生变化。在分批补料发酵罐中添加 Tween 80 已知会触发该生物体中 57 g/L L-谷氨酸的生产，而未添加表面活性剂时生产 24 g/L L-谷氨酸。为了响应环境波动，细菌细胞壁可能通过降低膜张力来激活机械敏感性通道。这些通道不仅作为渗透安全阀，防止低渗休克期间的细胞破裂。通过泵漏机制，它们持续释放 L-谷氨酸，有助于调节细胞膨压。

嘧啶生物合成、糖醇分解代谢和鞭毛运动受 L-谷氨酸过量生产条件的影响

为了研究 B. methanolicus MGA3 在 L-谷氨酸过量生产和外排下的遗传调控，我们旨在通过使用 RNA 测序比较在 MVcM 和 MVcMii 培养基中生长的培养物的转录本丰度来获得转录变化的总体概览。总共有 51 个基因在 B. methanolicus MGA3 中在 MVcMii 下生长时上调，35 个基因下调。大多数上调的基因集中在 10 个不同的基因组簇中，涉及代谢过程，如孢子形成、II 型分泌、磷酸盐转运以及甘露醇分解代谢和嘧啶生物合成。确实，在过量生产 L-谷氨酸的 B. methanolicus 突变菌株中先前观察到嘧啶生物合成基因的上调。

参与甘露醇分解代谢的基因上调是预期的，作为对 MVcMii 培养基组成中引入的碳源的内在反应。甘露醇的存在导致 operon mtlARFD 的上调，该 operon 对于 MGA3 中甘露醇的吸收和分解代谢至关重要。当甘露醇作为碳源使用时，与使用阿拉伯糖醇时相比，该 operon 也被上调。因此，本研究的结果证实了先前关于甘露醇补充对 B. methanolicus 生长培养基影响的研究。

此外，除了其对 L-谷氨酸生产的商业利益外，L-谷氨酸生物合成途径对于氮同化至关重要，并作为活细胞中几种必需化合物的构建模块提供者。在这些必需化合物中，L-谷氨酸在嘧啶和嘌呤核糖核苷酸的生物合成途径中提供氮原子方面起主要作用。相应地，嘧啶核苷酸生物合成 operon 内的基因在响应 L-谷氨酸过量生产时上调。未与嘧啶补救基因聚集在一起，一种参与这些核苷酸补救和相互转化的磷酸戊糖变位酶（deoB）也被上调。类似地，在 B. methanolicus 的 L-谷氨酸过量生产突变菌株中，这些基因也被上调。

此外，在 MVcMii 条件下，我们观察到与细胞突起相关的代谢过程基因簇的下调，属于磷酸转移酶系统（PTS）和阿拉伯糖醇代谢。阿拉伯糖醇，像甘露醇一样，是一种糖醇（戊糖醇），在微生物中作为阿拉伯糖和木糖等糖的还原产物生物合成。该化合物被确定为能够支持 B. methanolicus MGA3 生长的碳源。在这项研究中，负责 B. methanolicus 中阿拉伯糖醇吸收及其转化为木酮糖 5-磷酸的 atlABCD 基因簇在 MVcMii 条件下显著下调。这一发现与 López 等人的观察结果一致，他们报告在甘露醇条件下该基因簇的类似下调。当比较以甘露醇和阿拉伯糖醇作为碳源的生长时，他们发现在甘露醇上生长导致那些后来被表征为与 B. methanolicus 中阿拉伯糖醇分解代谢相关的基因下调。

在 MVcMii 条件下细胞突起基因的下调可能与 MGA3 在 L-谷氨酸过量生产中的代谢投资有关。鞭毛运动和趋化性已知是高度耗能的过程；例如，在 Pseudomonas syringae 中，鞭毛生物合成和功能消耗约占总细胞能量的 2%。此外，节约能量被认为是允许细菌将资源分配给其他代谢过程的一种策略。例如，在生物膜形成期间，细菌下调编码 FliD 帽蛋白的基因的表达，有助于节约能量和支持粘附。确实，B. methanolicus 的 L-谷氨酸过量生产突变体促进了细胞突起和 L-谷氨酸生产之间的拮抗调节。

脂肪酸代谢参与 L-谷氨酸过量生产

为了更深入地了解涉及差异表达基因的过程，特别是那些未在基因组中聚集的基因，我们进行了生物信息学蛋白质-蛋白质相互作用分析，对功能上和物理上相似的基因进行分组。该分析证明了在 MVcMii 条件下上调的基因分组在嘧啶生物合成、甘露醇分解代谢、磷酸盐转移和孢子形成过程中。相反，在下调基因中，除了聚集的阿拉伯糖醇分解代谢和细胞突起外，我们观察到与脂肪酸生物合成相关的基因。具体来说，fadR、fadF、mutB2 和 acdA 分别编码脂肪酸代谢调节蛋白、推定蛋白 FadF、甲基丙二酰-CoA 变位酶（大亚基）和酰基-CoA 脱氢酶。这些基因在 STRING 术语 CL:1622 下分组，表明一个混合类别，包括“碳代谢和碳水化合物转运”，错误发现率（FDR）为 7.45e-05。类似地，B. methanolicus 的 L-谷氨酸过量生产突变体在脂肪酸生物合成基因 fabI 和 fabG 中呈现突变，分别编码烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶 [NADH] 和丙二酰-CoA 酰基载体蛋白转酰基酶。在同一项研究中，突变体和野生型之间的转录组比较揭示了参与脂肪酸和甘油磷脂代谢的基因的协调变化。值得注意的是，编码甘油磷脂合成酶的基因被下调，而与膜脂质和脂肪酸代谢相关的基因被上调。这些代谢变化可能有助于 L-谷氨酸过量生产下细胞膜的结构变化。在 Bacillus subtilis 和 E. coli 中，脂肪酸生物合成的基因也分散在整个染色体上。此外，fadR 的下调可能对于理解本研究观察到的 B. methanolicus 中脂肪酸生物合成在 L-谷氨酸过量生产中的作用至关重要。B. methanolicus 中的 FadR 蛋白与在 Bacillaceae 中发现的一种 TetR/AcR 家族转录调节器表现出 82.29% 的同一性。然而，该调节器先前未被表征。E. coli FadR 的同源物仅存在于定殖动物或植物的 γ-变形菌的一个子集中，表明 FadR 调节参与这些生态位中脂肪酸的利用。在 B. subtilis 中，一种名为 FadR 的转录调节器抑制与 β-氧化相关的基因，但不作为脂肪酸生物合成基因的激活剂。值得注意的是，B. subtilis 和 E. coli FadR 蛋白表现出结构差异；B. subtilis FadR 属于 TetR 家族，而 E. coli FadR 是一种 GntR 样阻遏蛋白。

有趣的是，一种脂肪酸去饱和酶（des）在 MVcMii 条件下上调。该酶家族催化饱和脂肪酸转化为不饱和和多不饱和形式，这对 L-谷氨酸外排具有重要影响。细胞膜含有脂质，其疏水部分是线性饱和和不饱和脂肪酸。细菌可以响应环境变化改变其膜脂质组成。例如，E. coli 和其他细菌中饱和和不饱和脂肪酸的平衡发生变化，以在不同温度下保持适当的膜流动性。在本研究的背景下，我们假设在 B. methanolicus MGA3 中，不饱和脂肪酸比例的增加可能改变膜特性，如流动性或张力，这反过来可能调节机械敏感性通道的活性并影响 L-谷氨酸外排。这种提出的机制与脂质如何促成 E. coli 中机械敏感性通道的门控一致，其中不饱和脂肪酸程度的增加导致大电导机械敏感性通道（MscL）的打开并稳定 MscS 的开放构象。

此外，一个未分组的 3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]合酶基因 fabH，与脂肪酸生物合成途径相关，被确定低于蛋白质相互作用的既定 FDR。在 E. coli 中，脂肪酸生物合成由 FabH 启动，它执行丙二酰-乙酰载体蛋白（ACP）与乙酰-CoA 的缩合，启动脂肪酸延伸循环。细菌中的膜流动性与脂质和脂肪酸生物合成的代谢途径密切相关。通常，厚壁菌门（乳杆菌除外）在其脂质结构中具有支链脂肪酸。膜由两亲性脂质形成，主要是甘油磷脂。它们由甘油部分、两个脂肪酸和一个带有可变头基的磷酸基团组成。例子是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、心磷脂、赖氨酸-磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰丝氨酸。细菌也可以形成无磷膜脂质，如鸟氨酸脂质、硫脂质、二酰基甘油基-N,N,N-三甲基高丝氨酸、糖脂质、二酰基甘油、藿烷类等。我们的 RNA 测序分析揭示了谷氨酰胺和支链（BC）氨基酸转运蛋白的下调。在像 B. subtilis 这样的细菌中，BC 脂肪酸是膜脂质的主要组成部分。这些是通过掺入 BC 酰基-CoA（例如甲基丙二酰-CoA）作为前体合成的，该前体通过脂肪酸合酶途径延伸。因此，我们的发现是重要的，因为支链氨基酸作为甲基丙二酰-CoA 合成的前体，影响 BC 脂肪酸和脂质生产，最终影响膜组装。总的来说，这些结果表明 B. methanolicus MGA3 修改其膜组成以通过机械敏感性通道促进 L-谷氨酸外排。

B. methanolicus 的 MscS 与 E. coli 的相似并显示慢门控的序列指标

在这里，我们采用 B. methanolicus MscS 的生物信息学分析，旨在确认其小电导机械敏感性通道结构。在参与代谢物外排的 MscS 样转运蛋白中，例如 C. glutamicum 中的 MscCG 和 MscCG2，与非特异性的 E. coli MscS 相比，较慢的通道开放动力学被认为是对代谢物诱导应激的有效响应所必需的。多序列比对显示，B. methanolicus MGA3 中 MscS 的氨基酸序列与 E. coli MscS 和 C. glutamicum MscCG 的同一性分别为 25.8% 和 30.8%。图 S1 中呈现的序列标识进一步突出了高度多样化的 MscS 序列中第一个 TM 螺旋内疏水斑块的保守性，暗示了对功能至关重要的结构特征。值得注意的是，在 B. methanolicus MGA3 的基因组内，仅存在一个注释为小电导机械敏感性通道 mscS 的单一基因。然而，缺乏编码 MscL 同源物的基因。

此外，E. coli MscS 转运蛋白中 G113 和 N117 位置的突变已显示降低转运蛋白活性。B. methanolicus 中的 MscS 样转运蛋白缺乏 MscCG 转运蛋白中典型的延伸 C 末端，该末端参与减缓开放动力学。然而，MscCG 和 MscCG2 中的特定残基也与该特性相关，因为 MscCG2 尽管缺乏延伸的 C 末端，仍表现出比 E. coli MscS 更慢的开放动力学。值得注意的是，已鉴定出与 E. coli 转运蛋白相关的两个突变，G113S 和 N117D，而其他关键残基保持保守。在这里，新鉴定的 B. methanolicus 中的 MscS 样转运蛋白表现出与 C. glutamicum 转运蛋白 MscCG2 相同的突变，以及这些位置附近保守的序列，表明类似的功能行为。因此，与 C. glutamicum MscCG 和 MscCG2 的序列比较表明，B. methanolicus 通道动力学部分类似于 C. glutamicum，具有可能导致慢通道开放动力学并实现代谢耦合的类似突变。

在 E. coli 的质膜中，MscS 和 MscL 都证明了脂质特性和蛋白质功能之间的相互作用，在低渗休克期间冗余地作用以防止细胞裂解。细菌和古菌基因组通常宿主 MscS 编码基因，E. coli 拥有五个这样的基因。MscL 和 MscS 的同源物已被证明对于 B. subtilis 在对数生长期期间在低渗休克下的存活是必需的。因此，有人提出这种功能在革兰氏阳性菌中是保守的。mscS 样基因 NCgl1221 在历史上被确定为负责 C. glutamicum 中 L-谷氨酸排泄的基因。后来，在 C. glutamicum 基因组中，发现了 E. coli 的 MscS 和 MscL 的单一同源物。像在 E. coli 中一样，它们作为渗透安全阀，在低渗条件下调节细胞膨压。有趣的是，C. glutamicum 机械敏感性通道 MscCG 的打开主要通过“力来自脂质”的门控机制实现 L-谷氨酸的外排。

为了进一步探索 MscS 作为机械敏感性通道的结构组织，使用 AlphaFold 3 网络服务器预测了其结构。AF3 不仅预测单体的结构，还预测单体之间的相互作用以建立多聚体蛋白质结构。尽管它们的序列同一性低，B. methanolicus MGA3 衍生的 MscS 生物信息学 3D 结构类似于 E. coli 的结构。E. coli MscS 和 B. methanolicus MGA3 单体之间的比较揭示了高度的结构相似性。跨膜结构域由三个 α-螺旋组成，命名为 TM1、TM2 和 TM3a/TM3b。胞质区组织成一个 β-结构域、一个 α/β-结构域和一个 β-冠，这种结构排列也在 E. coli MscS 单体中观察到。像在其他 MscS 样转运蛋白中一样，单体组装成特征性的同源七聚体复合物。通过比较预测结构的跨膜区构象和来自 E. coli 的参考 MscS 转运蛋白，我们获得的结构处于关闭构象，但螺旋 TM1 和 TM2 比参考蛋白略长。

使用在线服务器 OPM 预测了与模型膜的相互作用，该服务器显示了蛋白质如何定向到革兰氏阳性膜中。OPM 服务器预测 B. methanolicus MGA3 和 E. coli 中的 MscS-膜复合物是相似的。从 MGA3 MscS 的预测结构，也可以确定钩脂的位置，已知钩脂在开放运动所涉及的分子事件中起重要作用。在关闭的 E. coli MscS 转运蛋白的晶体结构中，钩脂通过与带正电荷的残基 R88 和残基 Y27 相互作用而定位在其结合口袋中。有趣的是，在预测的 MGA3 MscS 结构的相同结构位置，可以观察到类似的化学环境，具有一个带正电荷的残基 K33 和两个氢键供体残基 S99 和 T29，这可能是钩脂的可能结合区域。

通道内的静电图显示富含赖氨酸残基的壁，产生了一个正电荷斑块，与运输带负电分子如 L-谷氨酸的通道作用一致。我们通过比较 E. coli 中 MscS 通道的开放和关闭构象的晶体结构分析了其开放机制。这种结构变化涉及跨膜螺旋的同步旋转和翻转。这种运动重新定向了位于通道孔中的苯丙氨酸残基的侧链，导致孔的打开。在图 2 中，这种关键的构象变化由同源七聚体中一个单体的 Cα 的归一化平方波动表示。可以清楚地看到，单体的膜外部分不受任何运动的影响，而跨膜区经历的主链位移由类高斯分布描述。鉴于参考 E. coli 蛋白和 MGA3 通道之间的结构相似性，我们假设 MGA3 MscS 的开放机制表现出类似的动力学。

为了研究膜如何影响通道的动力学，我们将 MGA3 MscS 结构建模为一个弹性网络，其中每个残基由一个以 Cα 为中心的节点表示，并通过弹簧与其他节点连接。类似地，膜被建模为一个弹性网络，其中节点代表脂质分子组，类似于磷脂双层内的相互作用。将蛋白质-膜系统表示为两个弹性网络使我们能够通过正态模式分析快速评估蛋白质的动力学，这是一种快速计算方法来获得对蛋白质主链动力学的见解。使用 NMA 评估的基本运动根据其频率进行排名，排名最高的运动是最慢的，因此生物学上最相关。MGA3 MscS 一个单体的最慢运动的平方波动报告在图 2E 中。该运动的特点是 TM α-螺旋的旋转与胞质结构域的反旋转同时发生。值得注意的是，MGA3 和 E. coli 蛋白中 TM α-螺旋的开放运动有相似性。然而，NMA 不能完全捕捉 MscS 的开放动力学，因为该运动也涉及侧链动力学，而侧链动力学未在模型中考虑。尽管有这种限制，MGA3 MscS 的最慢运动仍然捕捉到了与通道打开和关闭相关的膜动力学的一个关键方面，即螺旋的旋转。

我们研究了膜特性对 MGA3 MscS 动力学的影响，以解决通道在多大程度上可能受到来自膜的机械信号的影响。这是通过增加膜节点的大小来实现的。由于膜的体积保持恒定，这实际上降低了膜弹性网络模型中的磷脂密度。嵌入较低密度膜的 MGA3 MscS 的 NMA 揭示了最慢运动动力学的变化。TM 螺旋的旋转速度变得比胞质区更快，并且涉及更大比例的螺旋。这表明改变膜的特性影响 MGA3 MscS 的开放动力学。该模型加强了本研究中观察到的对 L-谷氨酸过量生产的调节反应，其中在 MVcMii 条件下观察到脂肪酸去饱和酶的上调，表明不饱和脂肪酸的形成。因此，MGA3 膜内脂质密度或组成的变化很可能通过 MscS 触发 L-谷氨酸的外排。B. methanolicus MGA3 当膜被拉伸时可能采用这种机制，促进其机械敏感性通道 MscS 的打开。未来的研究应通过定点诱变和 L-谷氨酸外排分析，实验研究 MscS 中已鉴定氨基酸残基的功能作用。这样的工作将有助于验证生物信息学预测，并提供对 B. methanolicus 中 MscS 介导的 L-谷氨酸外排分子机制的更深入见解。

生物素供应增加减少 B. methanolicus 中的 L-谷氨酸生产

接下来，我们评估了体内诱导膜张力条件下的 L-谷氨酸生产。Hoischen 和 Kr?mer 于 1990 年对 C. glutamicum 进行的研究表明，在生物素限制条件下，C. glutamicum 中膜脂质的总量几乎减半，并且膜中饱和与不饱和脂质（主要是棕榈酸（C16:0）和油酸（C18:1））的比例增加。他们提出了可能存在一种载体介导的 L-谷氨酸分泌系统，该系统响应由生物素限制诱导的脂质环境改变。

在乳酸菌中，向生长培养基补充 Tween 80 会下调内源性脂肪酸生物合成，并提高不饱和脂肪酸、油酸和环丙烷的水平。最近对多种 Lactobacillus 菌株的研究表明