香芹酚与百里香酚的协同抗菌作用：针对细菌和假丝酵母物种的抗菌活性及生物膜抑制研究

《MicrobiologyOpen》：Carvacrol and Thymol, a Synergistic Antimicrobial Activity Against Bacterial and Candida Species

本研究系统评估了天然单萜类化合物百里香酚和香芹酚对浮游态和生物膜态细菌及假丝酵母（Candida）物种的抗菌效力、协同相互作用及细胞毒性。结果表明，尽管高剂量下存在毒性，但二者协同/叠加的相互作用为未来治疗和环境应用提供了支持，尤其在对抗耐药菌和真菌生物膜方面展现出潜力。

　　

Graphical Abstract

本研究评估了天然单萜类化合物百里香酚和香芹酚对不同人类细胞系的细胞毒性，以及对浮游态和生物膜态细菌和假丝酵母物种的抗菌效力及协同相互作用。尽管高剂量下表现出高毒性，但其协同/叠加的相互作用支持未来的治疗和环境应用。

ABSTRACT

当前抗菌化合物的成功受到微生物耐药性发展的削弱。使用天然化合物作为抗生素和/或抗真菌药物的替代品正在增加。精油，特别是其酚类化合物百里香酚或香芹酚的潜在用途引起了极大兴趣。本研究旨在通过最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度/最小杀菌浓度（MBC/MFC）评估这两种单萜对革兰氏阳性和阴性细菌以及各种假丝酵母物种在浮游形式的抗菌活性；通过结晶紫和XTT测定评估固着生长形式。此外，通过棋盘试验评估了酚类化合物之间以及酚类化合物与抗生素/抗真菌物质之间的协同效应，并通过MTT测定评估了针对三种不同人类细胞系的细胞毒性。获得的结果显示酚类化合物对细菌和假丝酵母物种在浮游和固着培养中均具有抗菌活性。香芹酚和百里香酚对所有测试菌株的MIC/MBC范围为125–250 μg/mL，而对假丝酵母物种的MIC/MFC范围为250至2000 μg/mL。几种单萜/抗菌化合物的组合在浮游和固着形式中均显示出低于MIC值的协同或叠加效应。香芹酚对所有测试的细胞系均有毒性（浓度>31 μg/mL）；而百里香酚仅对两个测试的细胞系有毒性（排除人类泌尿细胞系）。总之，尽管已证明对不同细胞系具有高水平的细胞毒性，但显示的叠加和协同效应可能允许它们在无毒浓度下的治疗用途，鼓励对这些物质进行进一步研究。

1 Introduction

抗菌剂的使用通过降低微生物传染病的致死率极大地促进了医学的进步。然而，抗生素的长期和广泛使用随着时间的推移导致了抗菌耐药性细菌的选择。抗菌素耐药性（AMR）被定义为微生物在抗菌剂存在下生存和传播的能力，是21世纪主要的公共卫生问题之一，使得越来越大的感染群体的预防和/或治疗非常成问题。此外，感染通常由能够形成生物膜的微生物引起，使其根除更加困难。生物膜基质与抗生素的相互作用，以及酶如β-内酰胺酶或氨基糖苷腺苷转移酶的作用和/或生物膜内微生物代谢活动的改变，都代表了对抗菌活动产生不利影响的因素。生物膜内细菌对抗生素耐药的其他原因可能包括抗菌靶位点的模拟、细菌生长速度缓慢和持久细胞的产生。在抗生素耐药细菌中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌（ESBL-Ec）代表从住院患者以及社区中频繁分离的两种物种。葡萄球菌属被认为是医院获得性感染的最常见原因之一，由于手术伤口或压疮、菌血症（导管）和败血症；它是一种机会性病原体，生活在30%–50%健康个体的前鼻孔中。金黄色葡萄球菌被认为是对人类最具致病性的物种，并可能涉及各种身体部位的严重侵袭性和/或毒性综合征：皮肤；骨骼系统；呼吸系统；泌尿系统；和中枢神经系统。在人体组织和医疗器械表面形成的生物膜通常参与金黄色葡萄球菌感染的发病机制，如肺炎、骨科感染、口腔感染、伤口感染和与囊性纤维化相关的肺部感染。MRSA菌株是一个主要的公共卫生问题，因为其流行病学和经济影响，在死亡率增加、住院时间和医疗成本方面具有严重后果。其在医院（HA-MRSA）和社区环境（CA-MRSA）中的传播意味着最初对金黄色葡萄球菌有效的抗生素今天不再有效，特别是在医院感染中。在大肠杆菌属中，大肠杆菌物种是人类微生物群的一部分，特别是肠道微生物群。几种大肠杆菌菌株，以及属于肠杆菌科的其他细菌物种和菌株，已经获得了产生质粒编码的β-内酰胺酶的能力。这些菌株称为超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），对几种抗生素耐药，如常用于治疗肠杆菌科感染的第三代和第四代头孢菌素。由ESBL菌株引起的感染可能发生在身体的任何部位，包括血液、器官、皮肤和进行过手术的部位。

AMR不是细菌的特权，也是真核微生物如假丝酵母的特权，假丝酵母是一种产生生物膜的霉菌，可能因不当使用抗真菌化合物而被选择。此外，由于抗真菌化合物的毒性限制了它们在高浓度的使用，真菌感染难以根除。真核机会性微生物假丝酵母是人类口腔、胃肠道、阴道和皮肤微生物群的一部分，包括约200种。在假丝酵母物种中，白色假丝酵母是几乎所有类型念珠菌病的主要原因，但其他新兴的非白色假丝酵母（NAC）物种，包括光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、热带假丝酵母和副假丝酵母，对患者构成严重的医院威胁。这些菌株可引起浅表口腔和阴道粘膜感染以及播散性系统和深部感染。假丝酵母也是一种生物膜生产者，这使得根除感染极其困难。与浮游细胞相比，生物膜细胞表现出改变的表型，由于表面诱导的基因表达。白色假丝酵母生物膜的一个显著特征是对各种抗真菌药耐药，包括广泛处方的药物氟康唑。此外，生物膜可以作为感染细胞的储存库引起再感染。毒性副作用限制了可用抗真菌药高浓度的使用；因此，需要新的策略来对抗与生物膜相关的白色假丝酵母感染。

这种复杂的情况，其中常见感染成为患者死亡的主要原因，不可避免地导致研究/引入补充治疗策略以使用常见抗菌剂。最近，使用天然化合物作为感染的治疗替代品已变得普遍。其中，研究最多的是精油；特别是它们的酚类成分因其高抗菌活性而受到越来越多的关注。根据意大利官方药典，精油是“不同化学构成的挥发性有机物质的复杂混合物，包含在植物中，通过蒸汽蒸馏、溶剂提取或适当的机械程序从中获得”。这些物质是次级代谢产物，在植物生长中不发挥生理作用，但主要与针对细菌、病毒和真菌感染的防御机制有关。然而，精油的活动不是恒定的，取决于其组成物质的浓度和比例。最近，注意力转向某些包含在精油中的成分，这些成分被发现在微生物领域具有生物活性：香芹酚和百里香酚。百里香酚和香芹酚都存在于属于唇形科的植物中，具体在：牛至（Origanum vulgare）、百里香（Thymus vulgaris）、马郁兰、香薄荷和Lippia gracili。这些酚类单萜以其芳香特性而闻名，并用于传统医学，因为其抗菌、抗氧化和抗炎作用。

本研究的目的是测定单萜香芹酚和百里香酚对细菌和真菌的抗菌活性及其对不同人类细胞系的细胞毒性。为此，我们测试了：（i）化合物对收集和多药耐药（MDR）细菌以及假丝酵母物种在浮游和固着形式生长的抗菌活性；（ii）当两种化合物一起施用或与抗生素/抗真菌剂组合时的协同效应；和（iii）化合物对不同人类细胞系的细胞毒性。

2 Materials and Methods

2.1 Microbial Strains and Growth Conditions

使用了两种收集菌株，大肠杆菌MG1655（ATCC 700926）和金黄色葡萄球菌ATCC 6538，以及两种临床分离株，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌（ESBL-Ec）。菌株在-80°C保存在甘油储备中，并直接从储备在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上培养，有氧孵育过夜在37°C。脑心浸液肉汤（BHI）接种来自TSA平板的一个或两个菌落，并用于细菌物种的浮游生长。细菌悬浮液浓度通过分光光度法测量，活力通过评估菌落形成单位（CFU）/mL。来自临床分离株的假丝酵母物种菌株，白色假丝酵母AIDS 68、光滑假丝酵母DSY562、热带假丝酵母45615和克鲁斯假丝酵母44956，在整个研究中使用。所有菌株对氟康唑耐药。每种菌株常规维持在沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上，有氧，在28°C。

2.2 Chemicals and Reagents

香芹酚、百里香酚、Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI）、3-(N-吗啉代)-丙烷磺酸（MOPS）缓冲液、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、庆大霉素（GM）和氟康唑（FLC）购自Sigma-Aldrich。乙醇、甲醇、冰乙酸、Tween 20、结晶紫（CV）和二甲基亚砜（DMSO）获自Merck KGgaA。沙氏肉汤和琼脂技术购自Biolife Italiana Srl。BHI和TSA购自Oxoid。SDA获自Difco。2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺（XTT）购自Thermo Fisher Scientific。丙酮获自Altmann Analytik GmbH & Co. KG。聚苯乙烯板、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、链霉素、谷氨酰胺和青霉素购自Corning。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）购自SERVA Electrophoresis GmbH。

2.3 Determination of Carvacrol and Thymol Minimum Inhibitory Concentration (MIC), and Minimum Bactericidal/Fungicidal Concentration (MBC/MFC)

对于细菌和假丝酵母物种，通过微量肉汤稀释法根据临床和实验室标准协会（CLSI）批准标准M27-A4，2020评估香芹酚和百里香酚的活性。对于细菌测定，96孔板最初接种100 μL BHI，包含百里香酚或香芹酚的连续两倍稀释，浓度范围从1.9到1000 μg/mL。在一个孔中不添加物质，作为生长对照。将1×10⁸ CFU/mL的细菌悬浮液接种到板的所有孔中，并在37°C孵育24小时。对于假丝酵母物种的临床分离株，通过香芹酚和百里香酚在RPMI 1640中补充MOPS和Tween 20（最终浓度0.01% v/v）的连续倍比稀释测定MIC。物质的稀释范围从4到2000 μg/mL。接种大小约为2.5×10³ 细胞/mL。板在28°C孵育24-48小时。MIC确定为未观察到可见细菌或真菌生长的最低物质浓度。通过从所有显示无可见生长的孔中接种10 μL等分试样到TSA或SDA平板上，评估体外杀菌或杀真菌活性（MBC/MFC）。平板在37°C或28°C孵育24-48小时，MBC/MFB定义为将菌株生长减少99.9%相对于接种物的最低浓度。添加乙醇或DMSO在百里香酚或香芹酚悬浮的相同数量的孔用于评估溶剂的可能抗菌活性。每个抗菌测定进行三次。

2.4 Antimicrobial Activity Against Fungal and Bacterial Biofilm

检查了百里香酚和香芹酚对24小时形成和形成中的细菌和真菌生物膜的抗菌活性。对于研究中考虑的所有细菌菌株，生物膜在96孔板上进行，接种200 μL细菌悬浮液1×10⁶ CFU/mL并在37°C孵育24小时。在37°C孵育4小时后，吸出培养基，去除未粘附细胞，用PBS洗涤并添加200 μL新鲜培养基。在4小时（开始生物膜形成）或24小时（预形成生物膜）后处理生物膜，单独添加香芹酚或百里香酚（在MIC浓度），或百里香酚/香芹酚与庆大霉素组合（在以下棋盘试验中产生协同/叠加效应的浓度）或香芹酚和百里香酚组合（在棋盘试验中具有叠加效应的浓度）。类似地，为了进行真菌生物膜，不同的假丝酵母物种在28°C在多孔板上生长24小时，用无菌PBS洗涤两次，然后在37°C重悬于RPMI 1640加10% FBS中2.5×10⁷ 细胞。在37°C在六孔聚苯乙烯板中孵育3小时后，吸出培养基，去除未粘附细胞并洗涤PBS。在3小时（开始生物膜形成）或24小时（预形成生物膜）后，单独添加香芹酚或百里香酚（在它们各自的MIC浓度）或百里香酚/香芹酚与氟康唑组合或香芹酚和百里香酚一起（在棋盘试验中产生协同效应的浓度，被添加。作为阳性对照，在所有实验中设置了接种微生物菌株而不添加物质的孔。对于每种测定的条件，使用CV测定评估生物膜生物量，并使用XTT测定测量生物膜代谢活性。

2.5 Quantification of Biofilm Biomass by CV

为了量化细菌和假丝酵母生物膜生物量，使用了能够对生物膜基质染色的染料CV。首先，在去除上清液并用PBS洗涤后，通过添加100 μL 99%甲醇15分钟固定生物膜。然后，冲洗掉甲醇并将板风干。随后，向孔中添加100 μL 0.1% CV溶液，并在接触20分钟后，在流动自来水下洗涤板。为了溶解结合的CV，向孔中添加150 μL 33%冰乙酸。使用自动酶标读数器Tecan Sunrise在590 nm测量吸光度。

2.6 Evaluation of Biofilm Metabolic Activity by XTT-Reduction Assay

通过XTT测定评估生物膜代谢活性，该测定通过四唑盐还原为甲臜来突出活性。在去除上清液并用PBS洗涤后，向孔中添加XTT-甲萘醌溶液。XTT-甲萘醌通过将XTT粉末溶解在预热的PBS（37°C）中至0.5 g/L制备。溶液通过0.22 μm孔径过滤器灭菌。在每次测定前，将XTT溶液解冻并补充甲萘醌，甲萘醌是溶解在丙酮中的10 mM储备液，最终浓度1 μM。板在37°C在黑暗中孵育3小时，然后使用酶标读数器Tecan Sunrise在492 nm测量吸光度。

2.7 Synergistic Interaction

使用棋盘试验确定香芹酚和百里香酚之间或与庆大霉素（GM）或氟康唑（FLC）组合针对细菌和假丝酵母物种菌株的协同相互作用。选择GM和FLC是因为所有分析的菌株根据EUCAST断点对这些药物表现出耐药性。因此，我们旨在研究它们与精油的组合是否可以降低MIC值并可能恢复其抗菌功效。

在96孔板中，混合50 μL每种抗菌剂的连续两倍稀释，按照用于评估MIC的相同肉汤稀释方法制备。一种物质的浓度水平放置，另一种垂直放置。测试的稀释范围对于微生物菌株围绕物质的MIC值（对于假丝酵母物种为1.9–500 μg/mL）和对于抗生素（对于GM为2–32 μg/mL范围，对于FLC为0.12–128 μg/mL范围）。然后，向每个孔中添加50 μL细菌悬浮液，对于细菌在BHI肉汤中为1×10⁶ CFU/mL，对于酵母在RPMI 1640中为2.5×10³，最终体积为150 μL，96孔板在37°C孵育24小时。

通过计算两种抗菌剂的分数抑制浓度指数（FIC_i）确定协同效应。使用的方程是：FIC_i = FIC_A + FIC_B = (MIC_A组合 / MIC_A单独) + (MIC_B组合 / MIC_B单独)，其中a和b是组合中每种物质的MIC（对于分析的孔），MIC_a和MIC_b是每种物质单独的MIC。

FIC_i值定义测试的两种物质之间的关系：FIC_i ≤ 0.5协同作用；0.5 < FIC_i ≤ 1叠加；1 < FIC_i ≤ 4无关；FIC_i > 4拮抗。

2.8 Cell Lines Cultivation

在几个人类细胞系上评估香芹酚和百里香酚的毒性：人膀胱癌T24细胞系；腺癌人肺泡基底上皮A549细胞系和人结直肠腺癌Caco-2上皮细胞系。这些细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC HTB-37），并储存在液氮中。T24细胞在RPMI中培养，补充10% FBS、2 mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。A549和Caco-2细胞在DMEM中培养，补充10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。培养物在37°C在湿润的5% CO₂气氛中孵育。

2.9 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)?2, 5-diphenyltetrazolium Bromide) Assay

为了研究香芹酚和百里香酚对人类细胞的毒性作用，进行了MTT测定。测试的细胞系是T24（从患有结直肠腺癌的男性的膀胱分离）、A549（从患有肺癌的58岁白人男性的肺组织分离）和Caco-2（从患有结直肠腺癌的72岁白人男性的结肠组织分离）。在96孔板中，向每个孔添加200 μL细胞悬浮液（10⁴ 细胞/孔），板在37°C、5% CO₂下孵育。24小时后，更换培养基为200 μL添加百里香酚或香芹酚的培养基。测试了不同浓度的香芹酚和百里香酚（125、62、31、15 μg/mL）。未处理的细胞作为对照。处理24小时后，更换培养基为200 μL添加MTT（5 mg/mL）的新鲜培养基，然后将板在37°C、5% CO₂气氛下孵育4小时。之后，去除含有MTT的培养基，并向每个孔添加200 μL DMSO以溶解在活细胞中形成的甲臜晶体。孵育15分钟后，使用自动酶标读数器Tecan Sunrise在570 nm测量吸光度，参考波长设置为620 nm。

2.10 Statistical Analysis

每个实验至少进行三次。使用GraphPad Prism 9统计软件包上的单向ANOVA检验确定统计显著性。数据表示为平均值±标准差（SD）。使用单向方差分析（ANOVA）分析组间平均差异的多重比较，并使用Dunnett多重比较检验比较配对样本。当p值小于0.05时认为差异显著。

3 Results

3.1 Determination of MIC, MBC, and MFC Values

通过MIC和MBC/MFC评估香芹酚和百里香酚对细菌和假丝酵母菌株的抗菌和抗真菌活性。对于所有测试的细菌菌株，香芹酚的MIC和MBC值相同（125 μg/mL），表明该物质对这些细菌物种具有杀菌作用。对于百里香酚，MIC和MBC值对于测试的两种金黄色葡萄球菌菌株（250 μg/mL）一致，而对于大肠杆菌菌株，MBC值为250 μg/mL，MIC值为125 μg/mL，表明仅对金黄色葡萄球菌菌株具有杀菌活性。百里香酚对金黄色葡萄球菌菌株的MIC值高于大肠杆菌菌株（250 μg/mL对125 μg/mL），表明对测试的革兰氏阴性菌具有更强的抗菌活性。在四种测试的假丝酵母物种上测试了香芹酚和百里香酚的抗菌活性。使用香芹酚在白色假丝酵母和光滑假丝酵母中获得最低的MIC值（250 μg/mL），而对于热带假丝酵母和克鲁斯假丝酵母，香芹酚的MIC值为500 μg/mL。所有检查的假丝酵母物种的香芹酚MFC为500 μg/mL。所有分析的假丝酵母菌株的百里香酚MIC和MFC值均≥2000 μg/mL，表明在假丝酵母物种中百里香酚的抗真菌活性低于香芹酚。

3.2 Carvacrol and Thymol Activity Versus Bacterial and Fungal Biofilms

为了验证香芹酚和百里香酚对预形成和形成中的细菌和真菌生物膜的抑制效果，我们进行了CV和XTT测定。图1A、C显示了当在细菌生物膜形成开始时（4小时）以MIC浓度（香芹酚：所有菌株125 μg/mL；百里香酚：大肠杆菌菌株125 μg/mL，金黄色葡萄球菌菌株250 μg/mL）添加香芹酚和百里香酚的活性，而图1B、D显示了当在预形成的细菌生物膜（24小时）以相同浓度添加物质时的活性。香芹酚和百里香酚均能够显著减少细菌生物膜的生物量和代谢活性。表2报告了生物膜生物量和代谢活性的减少百分比。如表所示，在形成和预形成的生物膜中，百里香酚获得了最高的生物膜减少百分比，表明百里香酚对细菌生物膜的活性高于香芹酚。

关于假丝酵母物种生物膜的香芹酚和百里香酚活性结果报告在图2中，该图显示了生物膜形成开始时（图2A、C）和预形成生物膜上（图2B、D）的生物量和代谢活性。表3报告了生物膜生物量和代谢活性的减少百分比。当在生物膜形成开始时添加时，香芹酚能够抑制所有假丝酵母物种的生物膜生物量，与每个对照相比（p < 0.01），在所有菌株中抑制约70%，除了克鲁斯假丝酵母（18%）。在百里香酚存在下观察到类似效果，尽管比香芹酚轻微，在白色假丝酵母、光滑假丝酵母和热带假丝酵母中抑制约40%，但对克鲁斯假丝酵母的生物膜没有效果。生物膜代谢活性在香芹酚存在下与每个对照相比（p < 0.01）在所有包括的假丝酵母物种中被抑制约90%。即使在百里香酚存在下，生物膜的代谢活性也显著抑制（p < 0.01），但仍然低于香芹酚，在白色假丝酵母、光滑假丝酵母和克鲁斯假丝酵母中约70%。当香芹酚添加到预形成的生物膜时，在所有假丝酵母物种中观察到生物量显著减少，除了白色假丝酵母，百里香酚仅能显著减少克鲁斯假丝酵母生物量。预形成生物膜的代谢活性在香芹酚存在下在白色假丝酵母、光滑假丝酵母和克鲁斯假丝酵母中显著抑制，减少70%至90%，在百里香酚存在下在白色假丝酵母（80%减少）和克鲁斯假丝酵母（47%减少）中显著抑制。

3.3 Synergistic Effect on Bacterial and Candida Strains

使用棋盘试验检测香芹酚和百里香酚之间、GM/FLC与香芹酚、或GM/FLC与百里香酚针对细菌和真菌菌株的协同相互作用。物质之间相互作用的类型，由FIC_i值表示，报告在表4中。对于细菌，我们仅观察到百里香酚和GM之间对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和MRSA菌株的协同效应（FIC_i = 0.37），而对于其他组合显示叠加效应（0.5 < FIC_i ≤ 1）。对于假丝酵母物种，使用香芹酚与FLC组合对白色假丝酵母、光滑假丝酵母和热带假丝酵母获得协同效应，具有不同的FIC指数（FIC_i），范围从0.12到0.50。FLC在百里香酚存在下在假丝酵母物种中没有显示协同活性。香芹酚与百里香酚的组合仅在白色假丝酵母和热带假丝酵母中显示协同活性，FIC_i值分别为0.24和0.375。然而，结果表明香芹酚与FLC的协同效应比与百里香酚组合更强，并且百里香酚和香芹酚的组合仅在白色假丝酵母和热带假丝酵母中协同。其他作者也报告了类似的结果，关于香芹酚或百里香酚与FLC在假丝酵母物种中的组合。仅在克鲁斯假丝酵母中，T + FLC的组合（FIC_i > 2）无关。在所有其他假丝酵母物种中，物质显示叠加效应（0.5 < FIC_i ≤ 1）。

3.4 Activity of Combinations of Carvacrol, Thymol, and Antibiotics/Antimycotics Against Bacterial and Fungal Biofilms

我们评估了香芹酚、百里香酚和抗生素/抗真菌剂组合对形成中和预形成的细菌和真菌生物膜的协同效应。使用的物质浓度是那些在棋盘试验中发现协同或叠加的浓度（表5）。

形成中细菌生物膜的结果显示（图3A–B）当香芹酚、百里香酚和GM以亚抑制剂量单独添加时，与未处理的生物膜相比：（i）香芹酚显著减少MRSA生物膜的生物量（30%减少）；（ii）百里香酚显著抑制所有测试的革兰氏阳性菌株的生物膜生物量和代谢活性（10%–20%减少），并显著减少所有测试的革兰氏阴性菌株的生物膜代谢活性（几乎50%减少）；（iii）庆大霉素能够显著减少所有测试菌株的生物膜生物量和代谢活性（15%–59%减少），除了金黄色葡萄球菌生物膜（表6）。与预形成生物膜处理相关的结果（图3C、D）显示：（i）亚MIC浓度的香芹酚无法抑制研究中所有测试物种的生物膜；（ii）百里香酚显著减少MRSA生物膜的生物量和代谢活性以及大肠杆菌生物膜的代谢活性；（iii）庆大霉素对所有考虑的菌株有活性。表6显示了在不同分析条件下获得的生物膜生物量或代谢活性的减少百分比。以粗体标记的百分比是那些在组合使用时显示比单独化合物更高的生物膜减少百分比（代谢活性和/或生物量）的百分比。详细来说，当化合物添加到形成中的生物膜时，观察到更高的减少百分比：Carv+GM组合，与香芹酚和庆大霉素单独相比，对MRSA和大肠杆菌菌株的生物膜生物量和代谢活性以及ESBL-Ec菌株的生物膜代谢活性显示出更强的活性；Thym + GM组合，在减少金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物膜生物量方面显示出更大的活性；和Thym + Carv组合，在