SARS-CoV-2非结构蛋白nsp4膜拓扑结构与双膜囊泡形成机制的结构解析

《Protein Science》：Structural insights into SARS-CoV-2 nonstructural protein 4 (nsp4) biogenesis

本刊特约推荐：该研究聚焦SARS-CoV-2复制转录复合体（RTC）关键组分——非结构蛋白4（nsp4），通过细菌/真核双模型拓扑定位实验，首次揭示其具有部分切割信号肽、三跨膜段及胞质取向C端结构，并证实非经典糖基化位点（N131IC）未被修饰。结合分子动力学（MD）模拟，构建了nsp4在脂双层的单体构象模型，为阐明其介导双膜囊泡（DMV）孔道组装及病毒RNA转运机制提供关键结构基础。

　　

1 引言

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）作为COVID-19大流行的病原体，其复制转录复合体（RTC）依赖于非结构蛋白（nsps）协同作用。非结构蛋白4（nsp4）作为最大的跨膜（TM）非结构蛋白之一，与内质网（ER）膜重构及双膜囊泡（DMV）形成密切相关。既往研究表明，鼠肝炎病毒（MHV）nsp4突变会导致DMV结构异常及病毒RNA合成缺陷，凸显其关键功能。然而，SARS-CoV-2 nsp4的膜拓扑结构及分子机制尚不明确，阻碍了对RTC组装机制的深入理解。

2 结果与讨论

2.1 nsp4序列的计算机辅助分析

生物信息学工具预测nsp4跨膜区数量存在显著差异（3-7个TM段），其中UniProt数据库标注6个TM段。值得注意的是，N端疏水区被MEMSAT和SPOCTOPUS预测为可切割信号肽，但该区域在多蛋白前体（pp1a）中因上游nsp1–nsp3存在而无法发挥典型信号肽功能。非经典糖基化序列（N¹³¹IC）在SARS-CoV同源蛋白中被报道可糖基化，但其在SARS-CoV-2中的修饰状态需实验验证。

2.2 nsp4在细菌细胞中的拓扑结构

通过PhoA-LacZα双报告系统检测nsp4截短体拓扑特征，发现E141、G164和D279位点位于周质腔，而H313、H362、P371等位点定位于细胞质。定量酶活分析（NAR值）证实nsp4具有N端TM段（可能为信号肽样序列）、大型周质环、三个TM段（279–313、313–335、346–362）及胞质C端（363–500），且TM段按序插入细菌膜。

2.3 首个疏水区被ER转运子识别为跨膜段

利用C_LTM糖基化报告系统验证nsp4第10–32位残基在真核细胞中的膜整合行为。实验显示该区域主要产生单糖基化产物，表明其被内质网转运子识别为跨膜段（或信号肽样序列），而非完全转运至腔内侧。

2.4 nsp4的信号肽酶切割与糖基化状态

在哺乳动物细胞中表达全长nsp4时，免疫印迹检测到约56 kDa的双条带。EndoH处理及信号肽酶抑制剂（cavinafungin）实验证实，快速迁移条带为信号肽部分切割产物。突变预测切割位点（²⁸TPVH³¹→丙氨酸/苯丙氨酸）可消除切割现象。比较基因组学显示N¹³¹IC糖基化位点仅存在于SARS相关冠状病毒中，且通过N131Q（非糖基化）与C133S（经典糖基化位点）突变实验，证实野生型nsp4在该位点无糖基化修饰。

2.5 nsp4在人类细胞中的拓扑结构

糖基化映射分析显示，截短至D279的nsp4可被糖基化，表明其位于ER腔内侧；而H313位点无糖基化，提示279–313间存在TM段。Y335和Y346位点糖基化证实313–335为TM段，且346–362间TM段使C端（362–500）定位于胞质侧。该结果与细菌模型一致，支持nsp4在真核膜中按序插入TM段的机制。

2.6 nsp4膜内结构的计算模拟

基于AlphaFold2预测结构进行分子动力学（MD）模拟，发现原始模型中H362和P371位点与实验拓扑数据冲突。通过重构335–373区域为直螺旋结构，使374–398螺旋定位于膜界面而非跨膜区。该区域具有高界面亲和性（ΔG_app^int = -5.8 kcal/mol），可能动态参与DMV孔道组装。去除信号肽后，N端胞外域流动性增强，提示其可能在与nsp3互作及DMV形成中发挥构象调节作用。

3 结论

本研究通过多维度实验数据明确了SARS-CoV-2 nsp4的膜拓扑特征：部分切割的信号肽、三TM段结构及胞质C端。结构模拟提示单体nsp4与nsp3–nsp4孔道复合体中的构象存在差异，可能反映其从单膜插入向双膜孔道组装的动态转变。非经典糖基化位点（N¹³¹IC）的未修饰状态及信号肽切割现象，为理解nsp4在病毒复制器官形成中的功能提供了新视角。该模型为靶向nsp4的抗病毒策略开发奠定了结构基础。

4 材料与方法

实验采用pKTop载体构建nsp4-PhoA-LacZα融合蛋白进行细菌拓扑分析；真核拓扑通过pCAGGS载体表达糖基化报告标签（NSTMGM/QSTMGM）验证。分子动力学模拟使用CHARMM36m力场，在POPC-CHOL（7:3）膜环境中进行1100 ns原子级模拟。所有结构数据已公开于ZENODO平台（DOI: 10.5281/zenodo.16649058）。