IgG Fc区H435F工程化：实现局部治疗的新策略——消除FcRn相互作用并保留蛋白A纯化能力

《Protein Science》：Immunoglobulin G Fc engineering for localized therapy: Eliminating neonatal Fc receptor interactions and ensuring purification using protein A

本综述系统阐述了IgG Fc区工程化在局部抗体治疗中的突破性进展。研究通过定点突变技术发现H435F替代能特异性消除新生儿Fc受体（FcRn）结合活性，同时保留与蛋白A（Protein A）的亲和力。该突变体在hFcRn转基因小鼠中表现出加速清除特性（t1/2=1.11天），且不影响蛋白A色谱纯化得率，为局部给药抗体药物的开发提供了创新解决方案。

　　

引言

单克隆抗体（mAbs）和双特异性抗体（bsAbs）已成为多种疾病的重要治疗手段。然而，全身给药可能导致不良反应且局部病灶药物递送效率低下。近期研究表明，通过改造免疫球蛋白G（IgG）Fc区消除与新生儿Fc受体（FcRn）的结合，可加速系统循环清除，提高局部用药安全性。但此类突变可能影响蛋白A结合能力，而蛋白A色谱是抗体大规模纯化的金标准。本研究旨在探索能同时消除FcRn结合且保留蛋白A亲和力的Fc区突变策略。

工程化Fc变体的设计与筛选

研究团队以消除免疫效应功能的IgG₁ L234A/L235A/G237A（LALAGA）为骨架，针对FcRn相互作用关键位点（Ile253、His310、His435和Tyr436）设计系列单点突变。通过瞬时表达系统制备双特异性抗体1（bsAb1）的Fc变体，采用CaptureSelect? IgG-CH1进行纯化以避免Fc区突变影响。表达产量（182-296 μg/50 mL）和单体纯度（>98%）与野生型（WT）相当，表明突变未影响抗体基本性质。

表面等离子共振（SPR）分析显示，I253A、H310D、H435A等突变完全消除人源和食蟹猴FcRn在pH 6.0的结合能力，而Y436位点突变仍保留弱结合活性。值得注意的是，H435F变体在丧失FcRn结合的同时，与蛋白A的结合亲和力（K_D=9.7 nM）和最大响应值（R_max=392.5 RU）与WT（K_D=10.5 nM）相当，其他突变体则出现蛋白A结合能力显著下降。

分子机制解析

结构模拟表明，His435在酸性环境中质子化后与FcRn的Asp130产生静电相互作用，而苯丙氨酸（Phe）缺乏质子化能力导致静电相互作用消失。相反，蛋白A与Fc的结合主要依赖疏水相互作用和范德华力，His435与Phe的结构相似性（均含芳香环）使得H435F突变不影响结合界面。酸性洗脱阶段（pH 3.0）的静电排斥主要依赖His310、Lys317等位点，H435F突变未显著影响蛋白A色谱洗脱得率。

体内外功能验证

在hFcRn转基因小鼠（Tg32）模型中，H435F变体表现出显著加速的清除动力学，半衰期（t_1/2=1.11±0.14天）较WT（5.28±0.87天）缩短约80%（p<0.01）。药代动力学参数显示其曲线下面积（AUC_0-∞）下降约80%，清除率（CL）提高5倍。等电聚焦和疏水作用色谱证实突变未引起显著理化性质改变，排除非特异性清除因素。

讨论与展望

H435F突变通过精确调控电荷特性实现FcRn结合消除，同时维持蛋白A纯化兼容性，解决了局部治疗抗体开发中的关键矛盾。该设计可防止局部给药抗体通过FcRn介导的跨细胞转运进入系统循环，提高靶组织滞留性。研究局限性在于未直接评估局部给药后的组织分布，未来需进一步验证其在眼内、呼吸道等局部给药场景的实际效果。

结论

本研究首次证实H435F突变在保持蛋白A结合能力的同时，有效消除FcRn相互作用，显著缩短抗体半衰期。该工程化策略为局部抗体疗法的开发提供了重要技术支撑，兼具产业化纯化便利性和药代动力学优化特性。