碳酸根离子诱导合浦珠母贝肌浆钙结合蛋白（Pf-SCP）钙解离及碳酸钙矿化的结构动力学机制

《Protein Science》：Calcium dissociation with carbonate ions from Pf-SCP, sarcoplasmic calcium-binding protein in Pinctada fucata, contributes to calcium mineralization for shell formation

本研究揭示了合浦珠母贝（Pinctada fucata）中肌浆钙结合蛋白（Pf-SCP）在贝壳形成过程中的关键作用。通过荧光光谱、扫描电镜-能谱（SEM-EDS）及分子动力学模拟，首次阐明碳酸根（CO32?）在特定pH（pH 9）下可诱导Pf-SCP的EF-hand结构域发生钙离子解离，并驱动碳酸钙（CaCO3）结晶。研究从原子层面解析了水分子取代氨基酸配体、碳酸根结合钙离子并最终触发解离的动态过程，为理解海洋生物钙转运与生物矿化机制提供了新视角。

　　

1 引言

生物矿化是无脊椎动物通过有机基质精确调控矿物形成的过程。合浦珠母贝（Pinctada fucata）作为典型研究对象，其贝壳主要由碳酸钙和少量有机基质构成。外套膜上皮细胞分泌钙离子、碳酸氢根/碳酸根离子及有机基质，其中酸性有机基质（如多糖和蛋白质）通过结合无定形前体促进晶体矿物形成。Pf-SCP（合浦珠母贝肌浆钙结合蛋白）是一种EF-hand蛋白，在钙离子浓度升高的人工海水中表达量显著增加，定位于整个外套膜上皮细胞，推测其在贝壳形成中负责钙离子转运。EF-hand蛋白家族的特征是螺旋-环-螺旋结构，其钙结合环由12个氨基酸组成，通过六个配位点（X、Y、Z、-X、-Y、-Z）以五角双锥几何构型结合钙离子。尽管对EF-hand蛋白的钙结合机制已有深入研究，但碳酸根离子存在下的钙解离过程尚不明确。阐明Pf-SCP的钙解离机制对理解钙转运及贝壳形成至关重要。

2 结果与讨论

2.1 Pf-SCP的整体结构

Pf-SCP晶体结构分辨率达2.0 ?，每个晶体包含三个单体、290个水分子和六个钙离子。单体由九个α-螺旋结构域组成，其中四个螺旋形成两个EF-hand结构域结合钙离子。EF1中钙离子配位氨基酸为D16、N18、D20、D27（双齿配体）、K22主链氧原子及与S24侧链氧形成氢键的水分子；EF2中配位氨基酸为D106、N108、D110、E114、E117（双齿配体）及Q112主链氧原子。静电表面分析显示两个EF-hand区域带负电，为钙离子结合域。

2.2 荧光光谱揭示碳酸根诱导的钙解离

通过检测rPf-SCP（重组Pf-SCP）内在荧光光谱变化（激发波长280 nm），发现500 mM Na₂CO₃（pH 9）可诱导钙解离，其荧光峰位移与EDTA处理或apo-rPf-SCP（钙游离形式）相似，而50 mM Na₂CO₃无此效应。ICP-MS测定显示holo-rPf-SCP钙结合比为2.0±0.1，apo-rPf-SCP为0.6±0.2。进一步实验表明，500 mM NaHCO₃（pH 8）不引发解离，证实碳酸根（非碳酸氢根）在pH 9下特异性触发钙解离。Pf-SCP的EF-hand序列分析显示其EF1中第三位点为Asn（N18）、第十二位点为Asp（D27），EF2中第三位点为Asn（N108），这些替代已知会降低钙离子亲和力，可能促进碳酸根介导的解离。

2.3 rPf-SCP合成碳酸钙的表征

通过超滤去除游离钙离子后，采用碳酸铵扩散法向rPf-SCP溶液提供碳酸根。SEM图像显示合成颗粒为菱面体状，表面有孔洞，与生物矿化相关有机基质调控的碳酸钙形貌一致。EDS谱图显示碳、氧、钙特征峰，证实沉淀为碳酸钙。

2.4 无碳酸根时Pf-SCP的构象稳定性

分子动力学模拟采用多态离子模型描述钙离子。1 μs模拟中，Pf-SCP的RMSD稳定在0.15 nm，半径陀螺（R_g）恒定于1.59 nm。RMSF分析显示α-螺旋区域最稳定（RMSF≈0.05），环区波动较高（RMSF>0.1），但EF-hand环区因钙离子配位几何而波动较低。距离分析表明EF2中氧原子波动性高于EF1，提示EF2钙结合稳定性较低。MMPBSA结合能分解显示酸性氨基酸（Asp、Glu）贡献较大，而Asn（N18、N108）因缺乏负电荷导致结合能为正值，不参与稳定钙结合。

2.5 碳酸根存在下钙解离的分子动力学

添加1 M碳酸根后，Pf-SCP的RMSD增至0.2 nm，但R_g保持不变，表明碳酸根引起局部构象变化而非整体结构扩张。距离分析显示，EF1中D27（双齿配体）和EF2中E117与钙离子距离最稳定。钙解离发生于EF1（Repeat 2, 631 ns）和EF2（Repeats 1–3, 327–715 ns）。解离过程分三步：首先水分子取代EF-hand中氨基酸（如N18、S24、N108）配位钙离子；随后碳酸根结合钙离子，形成负电荷（碳酸根）-正电荷（钙离子）-负电荷（氨基酸）三层结构；最终钙离子脱离EF-hand，与水分子和碳酸根形成复合物。模拟轨迹显示钙离子释放方向多样，不同于钙调蛋白C端叶中双EF-hand协同解离模式。

3 结论

研究表明碳酸根离子可诱导Pf-SCP发生钙解离并驱动碳酸钙形成。分子动力学模拟从原子层面揭示水分子替代氨基酸配体、碳酸根结合引发不稳定性最终导致解离的机制。该研究为理解EF-hand蛋白钙解离过程及贝壳钙转运提供了理论基础，但Pf-SCP在碳酸钙晶体生长中的具体作用及体内碳酸根与蛋白质互作机制仍需进一步探索。

4 材料与方法

rPf-SCP通过pET-28a载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经镍柱纯化、凝血酶切除His标签及尺寸排阻色谱获得高纯度蛋白。晶体通过坐滴气相扩散法生长，X射线衍射数据在SPring-8 BL44XU采集，使用XDS处理，通过分子替换（AlphaFold模型）和Phenix精修解析结构。荧光光谱使用FP-6500光谱仪测定。碳酸钙合成采用碳酸铵扩散法，SEM-EDS分析加速电压为5 kV（形貌）和20 kV（元素）。分子动力学模拟使用GROMACS 2024.2和CHARMM36m力场，钙离子采用多态离子模型，体系中性化后添加1 M碳酸钠，模拟时长为1 μs，重复三次。结合能计算采用gmx_MMPBSA工具。