Aha1保守基序协同调控Hsp90 ATP酶活性的分子机制研究

《Protein Science》：Collaboration between two conserved sequence motifs drives ATPase stimulation of Hsp90 by Aha1

本文揭示了分子伴侣Hsp90共激活因子Aha1中两个高度保守基序（NxNNWHW和RKxK）的协同作用机制。研究发现RKxK基序中的K60残基在ATP水解前促进NxNNWHW基序的结构组织，而NxNNWHW基序的每个残基均能调节Hsp90的ATP酶速率和表观ATP亲和力。该研究为理解Aha型共伴侣如何通过调控Hsp90动力学影响客户蛋白折叠提供了新视角。

　　

1 引言

热休克蛋白90（Hsp90）是一种二聚体分子伴侣，通过ATP依赖的功能循环协助客户蛋白（如膜蛋白、激素受体、转录因子等）的折叠和成熟。其功能受共伴侣蛋白（如Aha1）的精密调控，后者通过调节Hsp90的ATP酶活性控制循环进程。Aha1的N端结构域包含两个高度保守基序：NxNNWHW基序（残基5–11）和RKxK基序（残基59–62），二者在调控Hsp90 ATP酶循环中发挥关键作用。近期冷冻电镜结构显示，ATP结合后Aha1的构象变化促使NxNNWHW基序与RKxK基序靠近，但二者协同作用的具体机制尚不明确。

2 在线方法

本研究通过位点定向突变构建酵母Aha1的NxNNWHW和RKxK基序丙氨酸突变体，利用大肠杆菌表达系统纯化蛋白，并通过酶偶联法测定Hsc82（酵母Hsp90同源物）的ATP酶活性。实验通过滴定辅伴侣浓度计算最大刺激速率（B_max）和表观亲和力（K_app），并利用酵母点阵实验验证突变体的体内功能。

3 结果

3.1 K60是Hsp90 ATP酶高效激活的关键残基

RKxK基序中K60A突变显著降低Hsc82的ATP酶刺激活性（B_max下降约50%），而R59A和K62A突变影响较小。同时，K60A突变显著降低Aha1与Hsc82的表观亲和力（K_app升高），提示K60在结合与功能激活中具有双重作用。

3.2 K60A突变模拟NxNNWHW基序缺失的表型

缺失NxNNWHW基序的Aha1^Δ11与K60A突变体均导致ATP酶刺激活性显著受损，且双突变体（K60A/Δ11）未出现叠加效应，表明K60是NxNNWHW基序功能执行的必要条件。

3.3 K60A突变改变Hsp90对ATP的表观亲和力

与野生型Aha1相比，K60A和Δ11突变均显著提高Hsc82对ATP的表观亲和力（表观K_m值降低），进一步证实K60通过调控NxNNWHW基序影响Hsp90的核苷酸结合状态。

3.4 K60A突变削弱Aha1的体内功能

在表达温度敏感型Hsc82^S25P的酵母模型中，过表达Aha1^K60A无法恢复菌株在高温下的生长缺陷，而野生型及其他RKxK突变体均能有效挽救表型，Western blot验证各突变体表达水平一致，说明K60的功能损伤并非由蛋白稳定性导致。

3.5 NxNNWHW基序各残基均参与ATP酶调控

对NxNNWHW基序的每个残基进行丙氨酸突变发现，除N7A外，其余突变（如N5A、W9A、W11A等）均使ATP酶刺激活性降至与Δ11突变体相近水平，且多数突变同时提高Hsp90对ATP的表观亲和力，提示该基序通过整体构象网络发挥作用。

4 讨论

本研究提出将RKxK基序命名为"结合与定位基序"（Binding and Positioning Motif, BPM），其通过K60残介导NxNNWHW基序（命名为"ATP酶刺激环"，ATPase Stimulation Loop, ASL）的空间组织，进而调控Hsp90的ATP水解循环。结构分析显示，ATP结合后K60向ASL的W9/W11残基靠近（距离<4?），可能通过影响Hsp90的"ATP盖"（ATP lid）动力学调节核苷酸交换。值得注意的是，酵母与哺乳动物Aha1的调控机制存在差异，可能与后者N端延伸序列或磷酸化修饰相关。该研究为靶向Hsp90-Aha1互动的药物设计提供了新靶点。