采用金纳米颗粒改性的丝网印刷电化学免疫传感器，用于检测前列腺癌生物标志物人激肽释放酶2

《Electroanalysis》：Screen-Printed Electrochemical Immunosensor Modified with Gold Nanoparticles for the Detection of Prostate Cancer Biomarker Human Kallikrein 2

本研究开发了一种基于印刷电极的金纳米颗粒免疫传感器，用于检测前列腺癌标志物KLK2。通过优化抗体（40 min）、BSA（30 min，1.5 mg/mL）孵育时间及pH 7.50、0.01 mol/L磷酸缓冲体系，实现了0.15 ng/mL检测限和95.6%-102%合成血清回收率。该传感器具有高选择性（PSA干扰仅5.66%）、良好稳定性和重复性（RSD 1.55%-3.18%），为低成本、便携式前列腺癌诊断提供了新方案。

　　在当前癌症诊断与治疗技术不断进步的背景下，前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）作为影响老年人群的一种常见疾病，其早期诊断和治疗仍是医学界关注的重点。尽管已有多种检测手段，如PSA（前列腺特异性抗原）测试，但由于PCa在早期阶段通常缺乏明显症状，导致其确诊率较低，严重影响患者的预后。因此，寻找更加特异、灵敏且适用于实际临床环境的生物标志物成为提升诊断准确性的关键。

KLK2（组织型凝血酶原激酶2）作为一类与PSA同属kallikrein家族的蛋白质，近年来被广泛关注。研究表明，KLK2在PCa早期阶段的表达水平显著高于正常组织，同时其在前列腺切除术后几乎无法检测到，这使其成为一种具有临床价值的生物标志物。与PSA相比，KLK2在血清中的浓度较低，仅为PSA的约10%，但其在PCa发展过程中的变化趋势能够有效区分PCa与良性前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia, BPH）。这些特性使KLK2成为PSA检测的重要补充，特别是在需要提高诊断准确性和灵敏度的情况下。

然而，现有的KLK2检测方法主要依赖于酶联免疫吸附测定（ELISA）、液相色谱-质谱联用技术（LC–MS）、表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS）等，这些方法虽然在检测精度上具有优势，但往往成本高昂、操作复杂，难以实现快速、便携和点对点的检测。因此，开发一种简便、低成本且高效的检测手段成为迫切需求。在此背景下，电化学传感器和生物传感器因其高灵敏度、便携性以及多分析物检测能力，展现出巨大的应用潜力。

本研究提出了一种基于丝网印刷电极（Screen-Printed Electrode, SPE）的电化学免疫传感器，用于KLK2的检测。该传感器采用了一种自制的导电墨水，其主要成分包括石墨、碳黑和指甲油作为粘合剂，从而实现了低成本、易于制造和应用的目标。在电极表面，通过金纳米颗粒（Gold Nanoparticles, AuNPs）的修饰，增强了抗体的固定效果，进而提高了传感器的灵敏度和特异性。随后，依次固定KLK2特异性抗体、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）以及KLK2抗原，形成一个具有高度选择性的检测体系。

在传感器的构建过程中，对多个关键参数进行了优化，包括抗体和BSA的孵育时间与浓度、抗原孵育时间、支持电解质的pH值和浓度等。优化结果显示，抗体孵育时间为40分钟，BSA孵育时间为30分钟且浓度为1.50 mg/mL，抗原孵育时间为60分钟，支持电解质的pH值为7.50，浓度为0.01 mol/L。这些参数的优化不仅提高了传感器的性能，也确保了其在复杂样本中的稳定性和可靠性。此外，每次修饰步骤后，传感器均通过0.10 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.00）进行清洗，并使用氮气流干燥，以减少干扰因素和非特异性结合。

为了进一步验证该传感器的性能，进行了选择性、重复性和稳定性研究。选择性测试显示，传感器在存在多种可能干扰物质的情况下，仍能准确识别KLK2，表明其具有良好的特异性。重复性测试中，四个相同条件下制造的传感器表现出一致的电化学响应，其相对标准偏差（RSD）仅为1.55%，说明该方法具有较高的可重复性。稳定性测试则表明，传感器在4°C低温环境下可稳定保存30天，且电化学响应的变化率仅为3.18%，证明其具有良好的长期稳定性。

在实际应用方面，该传感器被用于合成血清样本中的KLK2检测。实验结果显示，该传感器在不同浓度的KLK2样本中表现出较高的回收率，范围在95.6%至102%之间，显示出良好的检测效率。此外，通过构建分析曲线，该传感器在0.50–30.00 ng/mL的浓度范围内表现出良好的线性响应，其相关系数（R2）高达0.998，灵敏度为?1.36 × 10?? μA/ng/mL，检测限（Limit of Detection, LOD）为0.15 ng/mL，定量限（Limit of Quantification, LOQ）为0.49 ng/mL。这些数据表明，该传感器在临床诊断中具有显著的应用潜力，尤其适用于资源有限的环境。

与现有的检测技术相比，本研究提出的传感器不仅在成本上具有优势，还在操作简便性和检测效率方面表现出色。例如，传统方法如ELISA和SERS虽然在检测精度上较高，但其操作复杂、成本昂贵，难以满足日常检测需求。而本研究中的传感器通过简单的设计和材料选择，实现了快速、低成本的检测，同时保持了较高的灵敏度和选择性。此外，该传感器还能够检测到KLK2在血清中的微量变化，为PCa的早期诊断提供了新的可能性。

在实际应用中，该传感器的检测过程基于电化学信号的变化，通过观察KLK2与抗体结合后对电化学响应的影响，实现了无标记的直接检测。这种方法避免了传统标记技术的复杂性和成本，同时提高了检测的便捷性。此外，该传感器在合成血清样本中的表现良好，能够准确检测KLK2的浓度变化，并且在不同浓度下的回收率均达到较高的水平，显示出其在临床应用中的可靠性。

本研究的成果不仅为KLK2的检测提供了新的思路，也为其他生物标志物的检测方法提供了参考。通过优化传感器的结构和性能，研究团队成功开发出一种具有实际应用价值的电化学免疫传感器，能够在复杂生物样本中实现高效、特异的检测。这种技术的突破，有助于推动癌症诊断技术的进一步发展，特别是在资源有限和偏远地区，为早期筛查和实时监测提供了新的工具。

此外，该传感器的构建和使用还考虑了实际临床环境中的多种因素，如样品的处理、电极的稳定性和检测过程的便捷性。通过选择合适的材料和优化检测条件，该传感器能够在保证检测精度的同时，降低使用门槛，提高检测的可及性。这种创新性的设计不仅有助于提高检测效率，还为未来的生物传感器开发提供了新的方向，特别是在推动低成本、便携式诊断设备的发展方面具有重要意义。

综上所述，本研究提出的电化学免疫传感器为KLK2的检测提供了一种新的、高效的解决方案。通过优化各步骤的参数，结合金纳米颗粒和BSA的使用，该传感器在灵敏度、选择性和稳定性方面均表现出色。其低成本和易用性使其成为传统检测方法的有力替代，尤其是在需要快速、便捷和低成本检测的场合。未来，该传感器有望在临床诊断中得到更广泛的应用，并为癌症的早期筛查和实时监测提供重要的技术支持。