杨树木质生物质工程化生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸（PDC）揭示其代谢可塑性及生物炼制潜力

《Plant Biotechnology Journal》：Engineering 2-Pyrone-4,6-Dicarboxylic Acid Production Reveals Metabolic Plasticity of Poplar

本研究成功在杂交杨树（Populus tremula × P. alba）中构建了一条由微生物基因AroG*、QsuB、PmdA、PmdB和PmdC组成的合成代谢途径，实现了2-吡喃酮-4,6-二羧酸（PDC）的从头生物合成。工程化植株不仅积累了高价值PDC（达1.5 mg/g干重），还表现出显著的代谢重编程：木质素含量降低50%-60%，H单元增加10倍，半纤维素（尤其是木聚糖）增加70%-80%，并形成新型苯并二噁烷单元和VA衍生木栓质芳香物。这些细胞壁组成变化使糖化效率显著提升（葡萄糖释放量增加25%，木糖释放量提高2.5倍），同时增强植株耐盐性。该研究揭示了杨树代谢可塑性，为开发具有增强生物炼制特性及抗逆性的生物能源作物提供了新策略。

　　

1 引言

木质生物质作为生物燃料和生物基化学品发酵糖的有前途来源，其工业应用受到昂贵生物炼制过程的限制。一种可行的成本降低策略涉及增强生物质的可加工性和高价值副产品的生成。本研究旨在通过异源表达合成代谢途径，在杨树木质生物质中生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸（PDC），这是一种可生物降解塑料和高性能材料的关键构建块。该人工途径此前已在拟南芥中成功测试，但在实际生物能源作物中生产PDC的可能性仍有待证实。

杨树（Populus spp.）因其快速生长、高生物量产量和对不同环境条件的适应性，已成为生物能源和生物产品最有前途的生物质原料之一。本研究调查了通过异源表达由AroG*、QsuB、PmdA、PmdB和PmdC组成的从头生物合成途径在杨树木质生物质中生产PDC的可能性，以进一步增强杨树木质生物质的价值。

2 结果

2.1 PDC生物合成途径的表达改变植物生长特性

为了在杨树木质生物质中生产PDC，研究人员采用了先前在拟南芥中测试过的表达盒，其中包含五个基因：编码莽草酸途径第一个关键酶的反馈不敏感版本3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶的E. coli AroG*(L175Q)、编码将3-脱氢莽草酸转化为PCA的脱水酶的C. glutamicum QsuB，以及编码PCA 4,5-裂解途径酶以产生PDC的C. testosteroni PmdA、PmdB和PmdC。每个基因前均带有叶绿体转运肽序列，并分别由AtCESA4、AtC4H、AtGAUT12、AtC3′H和AtCESA7基因的茎特异性启动子驱动。

将包含这五个基因的单一盒转入杂交山杨（Populus tremula × P. alba）克隆INRA 717-IB4。在获得的四个独立转基因株系中，通过RT-PCR和绝对定量RT-PCR分析检测了转基因的表达。正如预期，在转基因株系中检测到所有五个基因的转录本，而在野生型（WT）植物中不存在。然而，五个转基因的转录本丰度不同；虽然大多数保持高表达水平，但PmdB在所有转基因株系中始终表现出最低的转录本丰度，表明AtC3′H基因启动子在杨树中的效率欠佳。此外，每个转基因的表达水平在不同独立转基因株系之间存在显著差异，其中1号株系对所有转基因显示出最高水平。

将鉴定出的转基因植物转移到无抗生素培养基中并进行无性繁殖，以获得每个独立转化事件至少五个重复。然后将转基因树木（此后称为PDC转基因植物）移栽到土壤中并在温室中生长。土壤生长的PDC转基因株系幼苗出现茎秆弯曲表型。然而，在最初的2个月生长期内，它们的总体茎长与WT植物相比差异很小。之后，PDC转基因植物开始表现出可辨别的生长减缓，在温室条件下土壤中生长4个月后，其茎长平均减少25%–30%。虽然4个月大的PDC转基因植物的茎直径显示很小或没有显著差异，但其同生分枝的数量显著增加了3到10倍。平茬后，再生的PDC转基因植物保持了类似的弯曲表型，茎长略有减少，同生分枝显著增加，但其茎直径在生长4个月后比WT增加了18%–30%。因此，再生的PDC转基因植物与WT植物之间的生物量产量没有显著差异。此外，PDC转基因株系去皮干燥的茎秆呈现褐色，与WT植物的浅色茎秆形成对比，暗示PDC转基因株系中潜在的代谢物改变。这些数据表明引入的PDC生物合成基因在杨树中具有功能。

2.2 PDC转基因杨树表现出新型代谢物的增强积累

随后，从土壤中生长4个月的植物的茎中提取甲醇可溶性代谢物，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量PDC。LC-MS分析在PDC转基因株系中解析出一种代谢物，其分子离子[M-H]^–的m/z为182.99，与标准PDC相同，表明所需PDC产物的积累。该代谢物在WT植物中不存在。转基因株系茎中积累的PDC滴度范围在1至1.5 mg/g干重（DW）之间，并且通常与不同株系间的转基因表达水平相关。

此外，紫外（UV）-LC-MS分析还解析出PDC转基因植物中积累的一些额外代谢物。峰1–4（P1–P4）显示出与PCA类似的紫外光谱，但具有不同的分子量，暗示它们是PCA衍生的缀合物。其中，P1显示分子离子[M–H]^–的m/z为315.07，相应的碎片离子m/z为153.019。162 m/z的中性丢失表明存在PCA葡萄糖苷缀合物。P4显示分子离子[M–H]^–的m/z为232.98，碎片离子m/z为153.02。80 m/z的中性丢失表明存在推定的PCA硫酸盐缀合物。甲醇提取物经酸水解后，所有这些化合物都转化为PCA苷元，其保留时间、紫外光谱和质谱与标准PCA相似。此外，在酸水解前后解析出另一种代谢物，其紫外光谱和质谱（分子离子m/z为167.03）与标准品4-羟基-3-甲氧基苯甲酸（即香草酸VA）相同。PCA和VA苷元的积累水平在4个月大的转基因植物中分别为1.73–4.20 mg/g DW和0.51–1.13 mg/g DW，而在WT中未检测到或仅检测到痕量。VA的形成可能通过内源性O-甲基转移酶的活性，由PCA进行3-O-甲基化产生。为了探索这种可能性，选择了16个据报道在杨树树皮和木质部组织中表达的O-甲基转移酶同源基因进行qRT-PCR分析。有趣的是，一个咖啡酸3-O-甲基转移酶（COMT）同源物OMT21在PDC转基因株系中的表达相对于WT增加了3到5倍，暗示其在PCA甲基化为VA中的潜在作用。与PCA和VA的从头合成和积累相反，杨树中固有产生的对羟基苯甲酸（p-HBA）的量在PDC转基因株系中出乎意料地减少了36%–63%。这些结果表明，从头PDC途径的表达不仅导致PDC的生物合成，还导致生物合成中间体PCA及其代谢衍生物VA在杨树木质生物质中的积累。

2.3 PDC途径的表达改变细胞壁结合酚类物质

杨树物种固有地在细胞壁木质素上积累p-HBA酯。由于PDC转基因植物在木质生物质中积累了新型甲醇可溶性酚类物质，研究人员进一步检查了这些化合物是否可能并入细胞壁聚合物。通过碱水解释放茎细胞壁残基（CWRs）中的壁结合酚类物质，并通过UV-LC-MS进行分析。结果显示，壁结合的p-HBA出乎意料地减少了80%–90%，而大量VA积累在PDC转基因株系的细胞壁中，范围在0.6至1.3 mg/g DW CWR。此外，在所有PDC转基因株系提取的壁结合酚类物质中检测到另一种化合物；其保留时间、紫外光谱和质谱（分子离子[M-H]^–的m/z为121.03）与标准品对羟基苯甲醛（p-HBAl）相似。PDC转基因株系中p-HBAl的含量在3至5 mg/g CWR之间，而WT中为0.43 mg/g CWR。杨树茎中对香豆酸（p-CA）的量较低，但在PDC转基因株系中显示了1.7–2.3倍的增加。有趣的是，尽管PDC转基因株系中可溶性PCA高水平积累，但在细胞壁残基的碱水解产物中未检测到或仅检测到痕量，表明PCA不作为碱不稳定的悬垂酯存在于细胞壁中。这些发现表明，PDC生物合成途径的表达不仅改变了可溶性酚类的库，还影响了壁结合酚类的并入。

2.4 PDC途径的表达改变木质素含量和组成

随着壁结合酚类物质变化的检测，研究人员进一步检查了转基因杨树细胞壁中木质素和多糖含量和组成的潜在变化。茎横切面的常规间苯三酚-HCl染色（显示代表木质素的紫红色）显示，与WT相比，PDC转基因植物木质部组织的纤维染色较弱，表明总木质素含量显著降低。同样，选择性将紫丁香基（S）-木质素单元染成紫红色的M?ule染色也显示PDC转基因植物的染色强度降低，表明S-木质素单元减少。尽管木质素含量明显减少，但通过甲苯胺蓝染色检查的整体维管结构在PDC转基因和WT植物之间没有显示显著差异，并且在PDC转基因木材组织中没有观察到严重的导管细胞塌陷。

与组织化学观察一致，使用乙酰溴可溶性木质素（ABSL）方法定量总木质素含量显示，4个月大的PDC转基因植物茎中仅含有9%–10%的CWR木质素，这相当于WT植物中测量的木质素量的50%–60%减少。通过诊断性硫代酸解（主要裂解β-O-4醚键）检查的木质素单体组成也显示，从PDC转基因株系的CWRs释放的S和G单体的产率比WT植物低50%–60%。基于硫代酸解的S/G比率保持与WT植物相似，约为2.6。然而，PDC转基因株系CWRs中对羟基苯基（H）单体的量显著增加了高达10倍。

为了进一步研究木质素结构的潜在改变，进行了二维（2D）核磁共振（NMR）分析，收集了从PDC转基因和WT对照植物茎CWRs制备的木质素富集细胞壁分数的异核单量子相干（HSQC）NMR谱。为了估计S、G和H木质素芳香单元的相对比例，对其相应的芳香信号进行了体积积分分析。与WT对照系相比，PDC转基因株系中S和G单元（?S_2/6和G₂相对于?S_2/6 + G₂ + ?H_2/6的百分比）减少了2%–6%，S/G单元比率（?S_2/6/G₂）仅有微小变化。同时，这些减少通过H单元比例（?H_2/6相对于?S_2/6 + G₂ + ?H_2/6）的显著增加得到补偿，在PDC转基因株系中达到8%–9%，而WT对照系中为1%或更低。此外，与壁结合酚类分析一致，木质素结合的p-HBA信号（?HBA_2/6相对于?S_2/6 + G₂ + ?H_2/6）在PDC转基因株系中 largely reduced to undetectable levels，而WT对照系中为7%–8%。 notably，检测到归因于木质素结合的VA（VA₂）和苯甲醛（BAl_ɑ）单元的信号增强，在PDC转基因植物中分别占?S_2/6 + G₂ + ?H_2/6的3%–5%。与WT对照系中观察到的这些信号的痕量相比，这代表了显著增加，支持了壁结合VA和p-HBAl增加并部分并入木质素的观念。然而，PDC转基因株系谱图中的VA₂信号可能由于与其他氧化木质素芳香单元的潜在重叠而被高估。此外，检测到新型木质素苯并二噁烷（BD）单元（可能源自PCA的交联），在PDC转基因株系中的水平为1%–2%（BD_ɑ相对于?S_2/6 + G₂ + ?H_2/6），而该信号在WT对照系中基本上检测不到。这表明，正如先前在表达QsuB的杨树中所示，PCA作为非典型木质素单体，在PDC转基因株系的木质化过程中参与与其他典型木质素单体（例如， monolignols）的自由基耦合。

总的来说，杨树细胞壁的化学和NMR数据揭示了木质素的显著改变，其特征是H单元的增加以常规S和G单元为代价，以及新型酚类物质在PDC转基因株系中的并入。这些结果强烈表明，PDC生物合成途径的表达将碳通量重新导向PCA、VA和PDC的生产，并干扰了 monolignol 的生物合成。

2.5 PDC途径的表达改变非纤维素多糖组成

除了分析木质素含量和组成，研究人员还检查了PDC转基因株系细胞壁多糖的潜在变化。结晶纤维素含量的定量显示PDC转基因株系与WT对照系相比没有差异，表明工程化PDC生产不影响纤维素沉积。相比之下，PDC转基因株系中半纤维素糖的总量增加了约60%–70%，显示为CWR的28%–29%，而WT中仅为CWR的17%–18%。 notably，木聚糖中主要单糖木糖增加了70%–80%，同时PDC转基因株系中鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖的量增加了40%–50%。这些数据表明，杨树中PDC生物合成的工程化不仅改变了木质素，也改变了基质多糖的沉积。

2.6 工程化PDC生物合成上调非纤维素多糖生物合成基因的表达

为了进一步探索PDC转基因植物细胞壁组成变化的潜在分子机制，研究人员检查了植物第10节间一组细胞壁生物合成相关基因的表达。虽然次级细胞壁形成的关键纤维素合酶基因CESA7和CESA8的表达水平没有检测到变化，但参与木聚糖主链延伸的阿拉伯糖基转移酶43B（GT43B）（拟南芥IRX9的功能直系同源物）的表达在PDC转基因株系中显著增加。此外，拟南芥IRX8和PARVUS的功能直系同源物半乳糖醛酸转移酶12（GAUT12）和糖基转移酶GT8E的表达在PDC转基因植物中也上调，表明PDC生物合成的引入导致细胞壁非纤维素多糖生物合成的分子重编程。然而，木质素生物合成基因如PAL2、C4H2和COMT2的表达没有明显变化。

2.7 PDC转基因植物表现出增强的糖化效率

木质素是阻止细胞壁酶水解的关键障碍，从而阻碍了木质纤维素生物质的有效利用。鉴于PDC转基因植物中总木质素含量的显著减少及其组成的变化以及细胞壁多糖沉积的增加，研究人员检查了转基因木质生物质的糖化效率。将WT和PDC转基因植物的茎粉用商业酶混合物Cellic CTec2（由纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶组成）进行酶消化。然后分析水解产物中的葡萄糖和木糖含量。结果显示，PDC转基因株系木质生物质中简单糖的释放有显著改善。具体而言，与WT植物相比，PDC转基因株系中葡萄糖的产率增加了10%–25%，而木糖的产率增加了150%–250%。这些发现表明，由于PDC工程策略而发生在细胞壁中的结构或组成改变增强了木质生物质的消化率。

2.8 PDC途径的表达增强木栓质沉积并赋予耐盐性

由于PDC转基因植物积累了大量的PCA和VA（工程化从头PDC途径的生物合成中间体或衍生物），研究人员探索了进一步将这些中间体转化为最终产物PDC的方法。在工程化从头途径中，PCA向PDC的转化涉及由PmdA、B和C基因编码的酶，分别由拟南芥GAUT12、C3′H和CESA7基因的启动子驱动。基因表达生物信息学分析显示，那些拟南芥基因对盐胁迫有强烈响应。因此，研究人员测试了盐处理是否能够进一步增强那三个转基因的表达并促进转基因杨树中PDC的生产。

将沙中生长一个月的WT和PDC转基因幼苗进行100 mM盐处理4周。盐胁迫抑制了WT和PDC转基因植物的生长，但它们的茎长以及地下和地上木质生物量产量相当。然而，WT植物叶片表现出严重的萎黄症状，而PDC转基因植物保持了健康且绿色的叶片，表明它们对盐胁迫有更强的耐受性。鉴于PDC转基因植物树皮厚度明显增加的观察，以及先前关于杨树树皮由聚酯木栓质（控制溶质运动并保护 against 生物和非生物胁迫的细胞外屏障）组成的报告，研究人员通过荧光染料fluorol yellow 088染色检测了WT和PDC转基因植物的树皮木栓质。PDC转基因植物的树皮显示出比WT显著更多的荧光染色细胞，表明木栓化增强。

随后，通过聚酯酯交换和气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析分析了树皮木栓质的化学组成。GC-MS从WT和PDC转基因植物的树皮无提取物残基中解析出一系列木栓质衍生的脂肪族和芳香族化合物。 notably，除了常见的木栓质芳香物阿魏酸盐外，在PDC转基因植物的木栓质中检测到大量的VA及其衍生物，以及一种最大紫外吸收在244 nm的未知化合物。这些化合物在WT树皮木栓质制备物中不存在，表明PDC转基因植物产生新型木栓质芳香物。此外，脂肪族木栓质单体亚油酸（C18:2 cis-9,12）和10,16-二羟基十六烷酸（10,16-OH C:16）的水平在PDC转基因株系的树皮中也增加了。类似地，PDC转基因植物根部的木栓质也含有高水平新并入的VA以及增加的亚油酸和24-羟基二十四烷酸（24-OH C24:0）水平。这些发现表明，杨树中PDC途径的表达改变了木栓质组成并增强了木栓质含量，这可能增强了有助于植物胁迫耐受性的屏障功能。

接下来，研究人员定量了盐处理转基因植物中PDC和酚类物质的积累水平。正如预期，在经盐胁迫和未经盐胁迫的WT植物茎的甲醇提取物中未检测到PDC，而PCA和VA水平保持低位且未变化。然而，经盐处理的PDC转基因株系中PDC的积累水平比未经处理的植物增加了 up to twofold。PCA和VA的积累水平在盐胁迫处理后也增加了2- to 2.5-fold，分别达到32 mg/g DW和6.5 mg/g DW。值得注意的是，在经盐胁迫或未经盐胁迫的沙中生长2个月的PDC转基因幼苗基部茎（10 cm）中的PCA和VA量远高于在土壤中生长4个月的植物中检测到的量。相应地，壁结合VA的水平在盐胁迫的PDC转基因植物中也增加了两倍；但PDC转基因植物细胞壁组分中p-HBAl和p-HBA的水平未受盐胁迫明显影响。有趣的是，WT中壁结合p-HBA的含量在盐胁迫下从1.8 mg/g CWR降至1 mg/g CWR，暗示木质素对羟基苯甲酰化在响应非生物胁迫中的可能作用。

鉴于树皮在介导植物对环境胁迫响应中的重要作用，研究人员还特别检查了盐处理前后WT和PDC转基因植物树皮中PDC和酚类物质的积累。与茎中观察到的类似，WT树皮不积累或仅积累痕量甲醇可提取的PDC、PCA和VA化合物，但在正常生长条件下，在PDC转基因株系的树皮中检测到大量这些化合物，特别是PCA含量达到32–36 mg/g DW生物量，而盐胁迫并未进一步增强它们的积累；PDC和VA的水平甚至下降。

3 讨论

对化石燃料和石油基材料可持续替代品的迫切需求加强了对可再生原料的兴趣。木质生物质提供了一个有前途的解决方案，提供可生物降解和高性能的材料，可以减少塑料污染和化石燃料依赖。在这项研究中，研究人员通过引入包含五个细菌基因：AroG*、QsuB、PmdA、PmdB和PmdC的从头生物合成途径，成功工程化了杂交山杨（P. tremula × P. alba）来生产塑料前体PDC。该途径在转基因杨树中具有功能活性，导致茎木质部和树皮组织中溶剂可提取的PDC积累高达0.15% DW生物量，证明了在生物能源作物中生产PDC的可行性。技术经济分析表明，目标化合物（包括PDC）在植物体内积累0.1%–0.3% DW可以达到与以最大理论产率40%–55%运行的微生物路线相当的生产成本。这些植物体内的产量和积累率足以确保生物炼制中的成本竞争力。

值得注意的是，工程化PDC生物合成诱导了显著的代谢转变，包括甲醇可提取简单酚类的积累、新型壁结合酯的并入、新型木栓质芳香物的形成、木质素和非纤维素多糖含量、组成或结构的实质性改变，以及增强的胁迫耐受性。这些变化伴随着木质生物质消化率的显著改善，糖化后葡萄糖释放量增加25%，木糖释放量增加2.5倍。然而，这些结果是在温室条件下生长的杨树中获得的。需要进一步的田间试验研究来确认这些改进的性状。

除了PDC，转基因杨树还超积累了简单酚类PCA，在沙中生长并喂养培养基的2个月大幼苗的茎中达到16.03 mg/g DW，特别是在树皮中达到33.6 mg/g DW。在盐胁迫下，PCA积累进一步增强，在茎中达到38.9 mg/g DW。在土壤中生长4个月的成熟植物的木材组织中检测到相对较低水平的PCA（约3.62 mg/g DW）。成熟土壤生长植物中PCA水平的降低可能反映了木材组织随衰老的生物量稀释效应和/或老年或死亡木质部细胞中酶活性的降低。PCA的超积累推测是由AroG*介导的莽草酸途径碳通量增加以及从头途径中QsuB实现的3-脱氢莽草酸有效转化共同导致的。尽管水平较低，但在单独表达QsuB的杂交杨树（P. alba × P. grandidentata）中也观察到了PCA的生产。PCA是一种天然酚酸，具有抗氧化、抗衰老和抗病毒特性，使其成为制药、功能性食品和化妆品中有价值的工业原料。它还被用作合成高性能聚合物和食品保鲜行业环保塑料的构建块，并作为吸附剂和封装剂应用于环境保护。

研究人员还在PDC转基因植物中检测到VA积累。这种化合物可能通过内源性区域特异性甲基化反应从PCA合成，揭示了杨树固有的代谢可塑性。一个COMT1同源物在PDC转基因植物中被发现显著上调。先前的研究表明，苜蓿COMT能够甲基化苯衍生物，如PCA、原儿茶醛和3,4-二羟基-5-甲氧基苯甲醛。需要进一步研究以确定这种杨树COMT同源物是否参与催化PCA向VA的转化。VA用作各种食品产品中的调味剂，并表现出一系列生物活性，包括抗癌、抗肥胖、抗糖尿病、抗菌、抗炎和抗氧化作用，使其在营养保健品应用中具有价值。在PDC转基因杨树中，相当一部分VA被并入木质部细胞壁（很可能附着在木质素上）作为酯连接的悬垂基团，并作为木栓质聚酯中的芳香组分。这表明内在的杨树酰基转移酶可以有效地识别VA-CoA硫酯，并将其与 monolignols 或羟基酸/脂肪醇结合，最终将VA并入细胞壁聚合物。先前，研究人员在杨树中鉴定并表征了两个关键的芳香族酰基转移酶：PHBMT1，一种对羟基苯甲酰CoA： monolignol 对羟基苯甲酰转移酶，和PtFHT1，一种羟基酸/脂肪醇羟基肉桂酰转移酶1，分别负责木质素酰化和木栓质/角质芳香物的形成。这两种酶对CoA硫酯都表现出一定程度的底物混杂性；因此，它们可能具有对VA-CoA的潜在活性。这些内源性催化酶（包括OMTs和酰基转移酶）的底物混杂性是杨树显著代谢可塑性的基础。

有趣的是，尽管PDC转基因株系中可溶性PCA（及其糖苷）大量积累，但在碱可水解的壁结合酚类物质中未检测到PCA。相反，发现PCA完全整合到木质素主链中，形成独特的苯并二噁烷结构单元。这表明，要么 monolignol-PCA 缀合物中的PCA酯经历排他性自由基耦合，通过醚键完全整合到木质素中（该键抗碱裂解），要么转基因植物中产生的PCA无法进行与 monolignols 的酯交换以形成 monolignol-PCA 缀合物；相反，它作为一种真正的木质素单体，通过自由基耦合直接参与木质素聚合。据报道，在单独表达QsuB的杂交杨树P. alba × P. grandidentata中，导致PCA糖苷作为悬垂酯部分附着在木质素上。然而，在本研究中，在PDC转基因杨树（P. tremula × P. alba）中既未检测到糖基化PCA也未检测到其苷元作为壁结合酯，突出了物种特异性代谢能力。

杨树中的木质素天然被p-HBA酰化。与先前在表达QsuB的杂交杨树中的观察类似，PDC途径的表达导致甲醇可提取和细胞壁结合的p-HBA显著减少。尽管p-HBA在植物中广泛存在，但其生物合成起源仍不清楚。已经提出了一些生物合成途径，其中涉及通过分支酸（微生物中常见）的莽草酸或通过β-氧化或非β-氧化途径的苯丙氨酸经由对香豆酸或对香豆酰CoA。本研究发现，PDC生物合成途径对莽草酸碳通量的转移显著影响了p-HBA的可用性，为进一步阐明p-HBA生物合成提供了有价值的遗传材料。此外，研究人员仅