通过CRISPR敲除TAC1基因揭示杨树柱状直立生长的遗传基础与分子机制

《Plant Biotechnology Journal》：Elucidating the Genetic Basis of Columnar Upright Architecture in Populus Through CRISPR Disruption of TILLER ANGLE CONTROL1

本研究首次在伦巴第杨（Populus nigra var. italica）中发现PnTAC1-1基因的无义突变，并利用CRISPR/Cas9技术对杂交杨（Populus alba × Populus glandulosa）的TAC1同源基因进行多位点编辑。通过连续两年的田间试验证实，TAC1-CRISPR杨树表现出稳定的直立分枝表型，其解剖学特征显示下侧叶柄细胞伸长增强且向重力性反应显著提升。转录组分析进一步揭示，TAC1缺失通过重构激素（如生长素和赤霉素）与光形态建成信号通路，驱动腋生分生组织的转录重编程，最终形成直立生长架构。该研究为林木株型改良提供了新靶点。

　　

引言

伦巴第杨（Populus nigra var. italica）因其独特的柱状直立生长习性被广泛用作景观树种，但其遗传机制长期未知。植物架构（包括分枝角度和器官空间分布）直接影响光能捕获效率与种植密度。前期研究表明，水稻TILLER ANGLE CONTROL1（TAC1）基因可通过调控分枝角度影响植株形态，但其在木本植物中的功能尚未明确。

伦巴第杨PnTAC1-1基因存在无义突变

通过对伦巴第杨基因组测序，发现其PnTAC1-1基因第三外显子存在T→A点突变，导致亮氨酸密码子（TTA）变为提前终止密码子（TAA），而PnTAC1-2未发现突变。该突变可能通过无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）机制导致基因功能丧失，与柱状表型密切相关。

CRISPR/Cas9介导的TAC1基因编辑杨树构建

针对杂交杨（P. alba × P. glandulosa, clone BH）中4个TAC1同源基因（PaTAC1-1、PaTAC1-2、PgTAC1-1、PgTAC1-2），设计两个sgRNA（sg1和sg2）靶向第三外显子。获得5株双等位基因突变株系（#8、#24、#25、#26、#27），其蛋白产物均被截短（最短仅49个氨基酸）。根据突变模式分为Type-1（#8、#24、#25、#27）和Type-2（#26）两类，后续以#24（Type-1）和#26（Type-2）为代表进行表型分析。

TAC1-CRISPR杨树呈现直立生长架构

与野生型BH相比，TAC1-CRISPR株系在试管苗阶段即表现出叶柄角度显著减小（BH: 48.2°±3.1°；#24: 26.4°±2.8°）。田间试验进一步证实，编辑株分枝角度稳定减小，而株高和茎粗无显著差异。利用geminiviral replicon载体（pPLID4）获得的非转基因编辑株也重现了这一表型，表明表型由TAC1突变直接导致。

叶柄组织不对称细胞伸长

解剖学分析发现，TAC1-CRISPR杨树叶柄下侧区域细胞长度显著增加，而上侧细胞层数无变化。这种区域性细胞伸长沿叶柄-茎连接轴（Part 1）方向尤为明显，提示其通过改变局部生长动力学驱动叶柄向上取向。

增强的向重力性反应

水平放置实验显示，TAC1-CRISPR株系在90°重力刺激下，茎和叶柄的弯曲恢复速度显著快于野生型。尤其位于茎下侧的叶柄表现出更强的向上弯曲能力，表明TAC1缺失提高了重力敏感性。

PtrLAZY1表达未受干扰

尽管LAZY1是调控分枝角度的关键基因，但RT-PCR和酵母双杂交实验表明，TAC1-CRISPR株系中PtrLAZY1表达量未变，且PtrTAC1-1与PtrLAZY1蛋白无直接互作。同时，另一分枝调控基因PtrWEEP的表达也未受影响，说明TAC1可能通过独立于LAZY1的途径发挥作用。

腋生分生组织转录组重编程

RNA-seq分析发现，TAC1-CRISPR株系腋生分生组织（AM）中有2641个差异表达基因（1108个上调、1533个下调），而茎顶端分生组织（SAM）转录组变化较小。GO富集分析显示，上调基因显著富集于生长素稳态、赤霉素响应及黄酮类合成通路。关键转录因子如AUXIN RESPONSE FACTOR 1（ARF1）、SCARECROW（SCR）、B-BOX 24（BBX24）和PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 5（PIF5）在AM中特异性上调，提示光信号与激素通路协同调控分枝角度。

激素与光信号通路协同调控模型

本研究提出工作模型：TAC1作为环境信号整合器，正常条件下抑制生长素在叶柄下侧的积累。TAC1缺失后，光响应因子（如PIF5、BBX24）和生长素转运蛋白（如PIN1、PIN6）表达上调，驱动生长素向下侧重新分布，同时赤霉素生物合成增强，共同促进下侧细胞伸长，最终形成直立架构。

讨论与展望

TAC1基因编辑杨树为林木株型改良提供了新策略，其高密度种植潜力有助于提升生物质产量。未来需进一步评估长期田间性能、木材品质及生态安全性，以推动其在可持续林业中的应用。