几何可调无支架肌肉生物构建体治疗容积性肌肉损失的创新策略

《Advanced Healthcare Materials》：Geometrically Tunable Scaffold-Free Muscle Bioconstructs for Treating Volumetric Muscle Loss

本文介绍了一种创新的无支架肌肉组织工程方法，通过模具引导细胞自组装形成高密度、几何形状可定制的模块化肌肉构建体（bioconstructs），用于治疗创伤性容积性肌肉损失（VML）。研究证实，预形成的细胞间相互作用能显著促进肌生成（myogenesis）相关通路（如肌肉收缩、肌原纤维组装），并在小鼠VML模型中有效改善肌肉功能恢复和血管再生。该技术结合医学影像与人工智能设计，展示了术中应用的临床转化潜力。

　　

生物制造与几何定制无支架模块化组织单元的可行性分析

研究团队开发了一种新颖的生物制造方法，用于生成用于肌肉组织工程的无支架模块化组织。该技术完全在模具中生成组织生物构建体，不包含任何外源性生物材料。该方法始于定制形状的3D打印，随后使用琼脂糖凝胶形成模具用于细胞接种，最终细胞自组装并贴合模具形状。为展示该技术的多功能性，研究人员成功使用绿色荧光蛋白（GFP）标记的C2C12成肌细胞或mRuby标记的人微血管内皮细胞（HMEC），制造出了圆环体、球形、星形、六边形等多种形状的组织构建体，甚至拼写出“STANFORD”字母序列，凸显了其制造复杂、用户定义形状组织架构的潜力。

无支架模块化组织单元能产生相对高细胞密度的组织构建体。研究表明，增加初始细胞接种密度会显著增加生物制造组织构建体的厚度。细胞活力测定显示，即使在高达400万细胞的高密度下，构建体内绝大多数细胞仍保持活力，钙黄绿素-AM（calcein-AM）染色显示活细胞占主导。共聚焦显微镜成像证实了细胞在构建体厚度内的均匀分布，以及在共培养中两种细胞群的均匀分布。对不同形状构建体的定量分析显示，在300微米深度内，细胞存活率均高于90%，表明该生物制造方法能维持高细胞活力。

模块化组织单元体外整合潜力评估

研究评估了相邻无支架模块化单元融合的可行性。通过将GFP标记的C2C12和mRuby标记的HMEC的L形模块化单元在琼脂糖模具中近距离放置，并在移除屏障后直接接触培养3天，共聚焦成像显示了在融合界面处的细胞相互渗透。荧光强度定量分析表明，在融合组织中，C2C12细胞的GFP荧光强度在靠近界面的近端区域比远端区域高10.26倍，HMEC的mRuby荧光强度在近端区域比远端区域高3.75倍。这些发现共同证实了在细胞水平上成功建立了细胞整合，暗示了构建多单元组织用于临床规模应用的潜力。

模块化肌肉单元的转录特征分析

为增强体内肌生成效率，研究在3D组织生物制造前引入了体外预分化阶段。将C2C12细胞在分化培养基中预分化0天（I组）、2天（II组）或4天（III组），然后进行3D组织构建。RNA测序分析显示，与未预分化的I组相比，预分化组（特别是III组）显著下调了炎症标志物（如Ccl3）和肿瘤发生标志物（如Prl2c2）。基因集富集分析显示，III组中肌肉功能和肌球蛋白组装基因显著上调。同时，细胞外基质（ECM）成分如胶原蛋白（Col1a1, Col1a2, Col4a1）和层粘连蛋白（Lama5）以及细胞间连接标志物如钙粘蛋白（Cdh1, Cdh2）和连环蛋白（Ctnna1, Ctnnal1）在预分化组中表达上调。这些结果表明，预分化阶段促进了组织特异性基因表达模式和内源性ECM成分的表达，有助于生成更具生物仿生性的工程组织。

预处理C2C12模块化肌肉单元在小鼠VML模型中的治疗效果测试

将经过2天（II组）或4天（III组）预分化的矩形固体形状C2C12组织构建体移植到小鼠胫骨前肌VML缺损处，评估21天后的肌肉再生情况。免疫荧光染色和定量分析显示，与未治疗的阴性对照组相比，II组和III组的再生区域面积和肌纤维密度均显著增加。CD31表达密度分析表明，III组的血管再生也显著优于对照组。肌纤维取向分析显示，新生肌纤维具有正确的横截面取向。进一步比较几何形状的影响发现，矩形固体形状的构建体在改善肌肉强直扭矩生成、肌纤维横截面积和周长方面均显著优于球形构建体，表明构建体几何形状对肌肉功能恢复和组织再生有重要影响。

原代人源肌肉构建体支持肌肉和血管再生，部分归因于预形成的细胞间相互作用

使用原代人骨骼肌成肌细胞形成的矩形固体肌肉单元进行移植实验。结果显示，与未治疗对照组相比，治疗组小鼠的肌纤维密度增加了3倍，毛细血管密度增加了1.5倍，并且在再生区域内出现了α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）标记的神经肌肉接头，而对照组则没有。为探究其机制，RNA测序比较了在模具中预形成2天的原代人肌肉构建体（具有细胞间相互作用）与在超低吸附培养皿中悬浮培养2天的单分散细胞（缺乏细胞间相互作用）的转录组差异。结果显示，预形成的模块化组织单元中，多个骨骼肌特异性肌球蛋白重链基因（如MYH7, MYH7B, MYH8）、钙粘蛋白基因（如CDHR5, CDHR13）、肌纤维组装基因（如TMOD1, TTN）以及肌肉再生相关通路（如Notch信号通路、前列腺素通路）基因表达显著上调。基因集富集分析证实，模块化组织单元中“成肌细胞融合”和“骨骼肌纤维分化”相关基因集显著富集。这些结果表明，预形成的细胞间相互作用使模块化肌肉单元在转录水平上更倾向于支持肌纤维组装和再生。

计算机辅助肌肉构建体原位移植的可行性

为推进临床转化，研究开发了一套计算机辅助自动化平台，用于术中组织移植。该系统包括定制制造的钝头针、带调节器的真空泵以及带有图形用户界面（GUI）的计算机控制软件，可实现模块化肌肉单元的可控吸取和沉积。演示实验中，成功将星形、圆环体形等复杂形状的C2C12肌肉构建体精确吸取并沉积到肌肉缺损部位，甚至实现了将球形构建体精确放置在圆环体构建体中心等复杂操作。该计算机辅助系统相比手动操作，在放置精度、可重复性和避免组织变形方面具有潜在优势。

迈向临床转化——从医学影像到定制几何设计

研究展望了一条未来个性化肌肉修复的临床转化路径。该流程始于通过高分辨率3D计算机断层扫描（CT）获取肌肉缺损的几何信息，然后利用计算机辅助设计（CAD）软件和人工智能（AI）将影像信息转化为数字蓝图，精确指定所需肌肉构建体的结构和尺寸。最终，在术中移植和组装几何可调的模块化生物构建体，以匹配复杂的伤口几何形状，实现可扩展和个性化的肌肉组织再生策略。

讨论

本研究的主要发现包括：1）开发了易于操作的几何可定制无支架肌肉组织构建体技术；2）证明了移植无支架模块化肌肉构建体可增强肌肉再生；3）深化了对无支架肌肉单元支持肌生成和细胞间相互作用的分子机制的理解；4）为临床转化提供了前瞻性的计算机辅助术中组织移植流程。模块化组织方法与吸取辅助放置技术相结合，通过直接定位预制的组织单元，有望增强其在目标肌肉缺损区域的整合和功能再生。研究结果揭示了构建体几何形状在骨骼肌等各向异性组织中的重要作用。矩形固体形状的构建体比球形构建体能更有效地促进肌肉功能恢复和肌纤维生长。该无支架方法为广泛的肌肉类型、损伤规模和物种的临床应用提供了潜在可能性。计算机辅助沉积系统相比手动操作，在确保可重复性和减少人为误差方面具有优势。吸取辅助的工程组织放置是一种新兴的生物打印技术，已应用于骨、软骨、心脏等多种组织模型的构建。本研究采用的预制方法允许组装不同几何形状的模块化组织单元，从而在组织形状、结构完整性和临床应用的扩展性方面提供了更大的灵活性。

结论

研究证明了一种简便的技术，可用于工程化制备具有可定制形状和尺寸的无支架高密度肌肉生物构建体，用于肌肉再生应用。无支架环境促进了支持肌生成的细胞间相互作用。将矩形固体形状的肌肉构建体移植到小鼠VML模型缺损处，可在21天后促进肌肉功能改善并诱导肌肉和血管再生。通过结合高细胞密度、几何可调性、结构整合性和支持功能再生的转录预备，这种无支架组织工程策略代表了一种有前景的VML治疗方法，并具有临床转化潜力。