用于胃肠道靶向体内药物输送的翻滚磁性微机器人

《Advanced Robotics Research》：Tumbling Magnetic Microrobots for Targeted In Vivo Drug Delivery in the GI Tract

本研究开发了一种空心双光子聚合微机器人，结合悬浮网格结构和heneicosane蜡密封，实现体温下稳定储存药物，并通过磁驱动和超声成像导航，利用FUS局部加热至42°C触发精准药物释放，并在大鼠结肠模型中验证了抗炎治疗效果。

　　在生物医学领域，实现一种可靠、按需、靶向的药物释放技术仍然是一个关键挑战，尤其是在复杂的体内环境，如消化道中。为了解决这一问题，研究人员开发了一种新型的中空微机器人，这种微机器人通过在悬浮微网格上使用一种机械互锁的蜡帽封口，确保了其在体内环境中的密封性。在体外实验中，装载有柔红霉素的微机器人在37°C（人体正常体温）下保持稳定，并在浴温超过40–42°C的阈值后，能在1分钟内实现完整的、阶梯状的药物释放。通过整合磁性和机器人超声系统，微机器人被引导通过直肠进入麻醉大鼠的远端结肠，并在实时条件下进行可视化追踪。聚焦超声（FUS）加热至42°C，触发了对声学造影剂的按需释放，形成了明显的对比增强效果。在未达到目标释放温度之前，没有药物释放发生，这突显了该设计在热敏性和防泄漏方面的高可靠性。治疗相关性在炎症性肠病（IBD）细胞模型中得到了验证：装载柔红霉素的微机器人在72小时后将MDA-MB-231细胞的存活率降低至预期的LC50值以下。这种结合了蜡帽和非侵入式FUS热触发机制的微机器人，实现了在体内环境下无泄漏的存储、实时导航和空间限定的药物释放，推动了无缆微机器人输送技术向临床可应用的、针对结肠的治疗方案发展。

药物输送系统的研究表明，许多药物由于系统性给药时与非目标组织的相互作用，导致了不良反应的发生。这些不良反应限制了药物的剂量，从而影响了整体的治疗窗口。为了克服这一局限，局部给药成为一种有效策略，它可以在目标区域提高药物浓度，同时减少系统性暴露，从而降低不良反应的可能性。局部给药可以通过多种方式实现，包括直接注射药物或药物载体。例如，药物释放剂已被成功用于治疗实体肿瘤的持续局部给药。与此同时，纳米颗粒载体成为靶向给药的主流方法，它们被设计为能够在血液中延长循环时间，并在目标部位增强聚集。然而，这些配方通常不适用于生物治疗药物。这一限制促使研究人员对小型载体，如水凝胶和微机器人，进行研究，这些载体可以运输纳克至微克级别的药物负载。这些载体通常被设计为对特定刺激做出反应的系统，以便在触发下释放药物。常见的外部刺激包括超声波和磁性梯度，它们已被用于驱动各种微机器人系统。通过应用这些原理，该领域已经开发出一系列移动的微机器人，这些机器人通常使用现代3D打印技术，如双光子聚合（TPP），以实现高架构自由度的制造。

这些平台从热驱动的“热夹钳”开始，它们可以自主地附着在黏膜组织上，实现长期的药物释放。此外，还有自我折叠或4D打印的结构，这些结构能够实现复杂的、预编程的形状变化。其他方法则专注于微储存器，如聚合物微容器或磁性引导的胶囊，它们被设计为在到达目标部位之前保护药物负载。为了在体内环境中导航这些设备，研究人员开发了复杂的引导方式，利用临床磁共振成像（MRI）扫描仪进行深层组织引导，或者利用聚焦超声（FUS）进行非接触式操控。尽管这些研究展示了各个组件的广阔前景，包括新型驱动器、引导系统和释放触发器，但在其协同集成以及在动态体内环境中的释放机制的稳定性方面仍然存在关键挑战。

在结肠这种复杂的结构中，微机器人通过翻滚运动表现出特别的潜力。基于这一概念，我们之前的工作引入了一种TPP打印的、磁性翻滚的胃肠微机器人，能够在FUS加热下释放药物，用于治疗IBD。然而，由于蜡帽的热不稳定性，可靠的释放仅限于台面测试，这阻碍了其在体内的应用。在这里，我们引入了一种新型的TPP 3D打印的、磁性驱动的翻滚微机器人，它通过直肠给药后，在外部磁场引导下穿越消化道，并通过FUS系统进行局部加热，实现按需释放。这种集成的导航和触发策略能够将大量药物以时空精确的方式输送，直接克服了我们之前研究中的可靠性问题，体现了精准医学的核心目标：在提高疗效的同时，减少非目标区域的暴露。因此，本研究的主要贡献如下：

首先，创新的3D打印微机器人外壳设计，结合了悬浮网格以提高热敏蜡的附着能力，从而确保通过局部加热实现体内可靠的按需药物释放。其次，设计了一种集成的磁性驱动系统和力控机器人超声成像系统，以实现闭环微机器人运动和实时成像。第三，系统性地制定了、表征和筛选了一种合适的生物相容性热敏微机器人蜡涂层，以实现按需的体内药物释放。第四，表征了在局部加热至生物安全温度下的微机器人药物释放曲线，以降低药物热变性的风险。最后，首次展示了在活体大鼠中通过FUS系统进行微机器人局部运动和加热以实现按需药物释放的实验。

为了在肠道这种复杂的结构中实现微机器人的导航，研究人员开发了一种翻滚运动策略。翻滚运动能够有效克服肠道中复杂的物理环境。在这一研究中，微机器人通过磁性驱动系统进行运动，该系统利用磁力和磁矩，通过调整磁场方向来实现微机器人运动的控制。这些力和矩决定了微机器人在磁场中的运动行为。此外，由于微机器人的小型化，它们特别适合于生物系统中的精确导航，能够进入人体中难以到达或狭窄的解剖区域。对于微创手术中的微机器人，TPP 3D打印已被证明是一种有效的方法。TPP 3D打印能够创建复杂的3D结构，并提高微机器人的设计灵活性和功能。

本研究中，微机器人被设计为能够响应外部磁场，通过集成永久磁体实现运动。值得注意的是，在微尺度下，磁力通常远小于磁矩，这使得磁矩成为微机器人运动的主要驱动力。这种磁矩与磁力之间的差异显著提高了翻滚作为运动策略的效率。此外，翻滚运动在减轻肠道中黏附力的影响方面也具有优势。当存在永久磁体时，微机器人会受到磁力的吸引，而磁矩则会使其与磁体的磁场对齐。因此，旋转永久磁体会导致微机器人同步旋转，从而产生翻滚运动。

微机器人通过翻滚运动可以实现精确的导航，这使其成为在体内复杂环境中的一种理想选择。TPP 3D打印技术被用于制造这些微机器人，以实现关键设计功能，包括空腔用于药物存储、圆形端口用于药物装载和释放、悬浮网格用于确保蜡帽的稳定性，以及一个用于插入立方微磁体的腔体。这些设计功能共同作用，使得微机器人能够实现高效的药物输送。此外，微机器人通过这种设计可以携带比传统微机器人更高的药物负荷，即微克级的药物，而不是纳克级。这大大提高了药物输送的效率。

在微尺度下，液体界面可能导致药物装载困难，因为表面张力的增加使得毛细力主导了药物的输送过程。气泡的去除成为一个关键问题。通过在微机器人上设置两个端口，研究人员可以利用毛细力将药物溶液从一个端口吸入，同时将空气从另一个端口排出。这使得微机器人能够有效地装载药物，而不会因气泡的存在而影响药物释放的效率。

为了实现热触发的药物释放，研究人员需要一种热响应材料，这种材料能够有效密封药物，具有与生物相容的转变温度，并且在体内环境下安全。在本研究中，微机器人通过悬浮网格设计使用了正二十烷蜡（一种直链和饱和的C21碳氢化合物），其熔点为41°C，且在体内环境下安全。然而，由于结晶过程中的体积收缩，这种蜡不能形成稳定的密封。悬浮网格通过机械互锁的方式与蜡结合，从而形成稳定的密封帽。这种密封帽能够在37°C的体温下保持附着，并在加热至42°C时熔化，从而触发药物释放。这种设计通过实验验证，能够实现药物的按需释放，而不会对肠道组织造成损伤。

为了确保在体内环境中安全和可靠地进行远程成像操作，研究人员结合了配备集成末端执行器力传感器的机器人操作器和超声成像系统。这种设置能够实现实时监测和控制超声探头与实验对象之间的接触力。在整个实验过程中，系统能够维持在-1 N参考力附近的安全力阈值，从而防止对实验对象或假体造成潜在的损伤。同时，探头的z轴轨迹形状与实验对象的解剖轮廓保持一致，使得微机器人能够精确地进行导航。

为了实现同时的治疗和成像功能，研究人员设计了一种定制的双探头支架，该支架能够同时容纳FUS探头和常规成像超声探头。这种双探头设计确保了在实验过程中两个探头的正确对齐和稳定固定。使用一个模拟的FUS设备进行实验，研究人员展示了该支架在实验流程中的有效性，显著提高了实验效率，减少了设置时间，并确保了治疗探头和成像探头之间的相对位置一致性。

在体内实验中，研究人员使用FUS系统对微机器人进行加热，以实现按需的药物释放。实验对象为活体的Sprague–Dawley大鼠，符合IACUC协议2002002016。图7a展示了微机器人在FUS激活前后的结构变化。在加热前，可见的蜡层覆盖着腔室，腔室内装有造影剂（CA）。在FUS应用和局部加热至蜡的熔点后，蜡层开始融化，从而确认了腔室的打开。通过实时的超声成像，研究人员能够观察到造影剂的释放过程，从而验证了FUS触发的释放机制。在未达到目标释放温度之前，没有发生任何药物释放，这进一步突显了该设计的高热特异性。

为了评估微机器人在体内的药物释放性能，研究人员进行了超声引导的FUS实验。实验中，微机器人被引入大鼠的结肠，并在实时条件下进行可视化追踪。通过调整磁性驱动系统，研究人员能够实现微机器人在结肠内的导航。当FUS被应用并局部加热至蜡的熔点时，微机器人释放其负载的药物。这种设计在体内环境下实现了无泄漏的药物释放，并且能够在不损害细胞或组织的情况下释放药物。此外，这种设计在体内环境中实现了对微机器人位置的精确控制，并确保了药物释放的时空准确性。

在体外实验中，研究人员评估了药物释放曲线，以确定在静止状态下微机器人释放药物的温度。考虑到结肠的温度为37°C，研究人员在38°C至42°C的温度范围内测试了药物释放效果。结果表明，当温度达到42°C时，微机器人能够实现阶梯状的药物释放。因此，所有实验均在预期的温度范围内进行。这种释放温度与之前通过DSC实验获得的正二十烷蜡的熔点一致。此外，所有重复实验均实现了完整的药物释放，这表明微机器人能够在不损害肠道组织或导致药物热变性的前提下，实现按需的药物释放。

为了评估正二十烷蜡的细胞毒性，研究人员遵循ISO标准10993-5，评估了蜡或其释放物对细胞的潜在毒性。为此，研究人员将NIH 3T3小鼠成纤维细胞培养在标准的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）中，并将这些细胞暴露于蜡中24小时，与未暴露的阴性对照组（仅DMEM）进行比较。如果蜡暴露组的细胞存活率低于阴性对照组的70%，则认为蜡具有细胞毒性。为了验证这一点，研究人员还使用了含有10% DMSO的DMEM作为阳性对照，这导致了细胞存活率的显著降低。结果表明，正二十烷蜡并不具有细胞毒性。较高的荧光强度可以归因于NIH 3T3细胞中由于正二十烷的存在而增加的线粒体活性。这些结果与正二十烷的安全数据表中报告的毒性数据相一致，其中皮肤的LD50为5 g/kg。结合对微机器人中镍涂层磁体的细胞毒性测试，以及使用生物相容性树脂打印微机器人的方法，研究人员能够进一步测试装载和密封的微机器人在体外释放药物后的短期治疗效果。

为了验证药物的生物活性，研究人员使用了MDA-MB-231乳腺癌细胞，并评估了从微机器人释放的柔红霉素的治疗效果。为此，研究人员首先计算了MDA-MB-231细胞暴露于柔红霉素后的LC50值。LC50值描述了在药物暴露下能够杀死50%细胞的剂量。如图8所示，通过4参数逻辑回归模型（4PL）计算出的LC50剂量为0.06 μM。接下来，研究人员评估了药物的生物活性是否因装载和释放过程而受到影响。考虑到报告的LC50值，研究人员将2.1 μM的柔红霉素装载到每个微机器人中，这样可以在LC50值下评估释放药物的生物活性。结果表明，释放的柔红霉素对细胞的存活率有显著降低，这表明微机器人能够将药物有效地输送至目标细胞。

为了验证药物的生物活性，研究人员使用了MDA-MB-231细胞，并将其暴露于柔红霉素。这些细胞对柔红霉素有良好的反应，因此被选为评估药物生物活性的模型。柔红霉素被选为一种已被广泛研究的治疗化合物，它具有荧光特性，便于定量分析。研究人员将细胞培养在完全的DMEM中，并将它们接种到96孔板中，每孔的细胞密度为5,000个细胞。在培养24小时后，研究人员移除了培养基，并添加了含有柔红霉素的FluoroBrite DMEM。测试了八种不同的柔红霉素浓度，包括不含柔红霉素的阴性对照组。细胞被培养72小时后，每个孔被处理为10%的PrestoBlue。在培养1小时后，研究人员使用Biotek Cytation 5设备测量荧光强度，使用560 nm和590 nm的激发和发射波长。通过测量的荧光强度和已知的浓度，研究人员拟合了一个4PL模型，以获得柔红霉素的LC50值。LC50值，也称为半最大致死浓度，是减少细胞存活率50%所需的药物浓度。LC50值在制药领域非常重要，因为它直接反映了药物的效力，使得研究人员能够评估药物的生物活性是否因装载或释放过程而受到影响。

为了进一步验证药物的生物活性，研究人员将三个微机器人装载了33.3倍的LC50浓度的柔红霉素，并将每个装载的微机器人放入单独的含有100 μL FluoroBrite DMEM的试管中。每个试管被放置在44°C的水浴中1分钟，导致蜡融化并释放药物进入培养基。每个试管被移入含有细胞的孔中，并被培养72小时。使用PrestoBlue测量细胞的存活率，并与4PL模型进行比较。结果表明，微机器人释放的柔红霉素具有良好的生物活性，与未暴露的细胞相比，细胞存活率显著降低，这表明微机器人能够有效地将药物输送至目标细胞。

在本研究中，研究人员开发了一种集成的微机器人控制系统，包括磁性驱动系统和机器人超声成像系统，以实现微机器人在体内的导航和药物释放。这种系统通过实时控制微机器人运动和成像探头位置，确保了适当的力控制，从而维持成像的聚焦状态。此外，研究人员还开发了一种机器人超声力控制策略，以确保在导航过程中保持稳定的力平衡，防止对实验对象或探头造成损伤。通过这种策略，研究人员能够实现微机器人在体内环境中的精准导航和药物释放。

为了验证药物的生物活性，研究人员使用了MDA-MB-231细胞，并将其暴露于从微机器人释放的柔红霉素。这些细胞对柔红霉素有良好的反应，因此被选为评估药物生物活性的模型。研究人员将细胞培养在完全的DMEM中，并将它们接种到96孔板中，每孔的细胞密度为5,000个细胞。在培养24小时后，研究人员移除了培养基，并添加了含有柔红霉素的FluoroBrite DMEM。测试了八种不同的柔红霉素浓度，包括不含柔红霉素的阴性对照组。细胞被培养72小时后，每个孔被处理为10%的PrestoBlue。在培养1小时后，研究人员使用Biotek Cytation 5设备测量荧光强度，使用560 nm和590 nm的激发和发射波长。通过测量的荧光强度和已知的浓度，研究人员拟合了一个4PL模型，以获得柔红霉素的LC50值。LC50值，也称为半最大致死浓度，是减少细胞存活率50%所需的药物浓度。LC50值在制药领域非常重要，因为它直接反映了药物的效力，使得研究人员能够评估药物的生物活性是否因装载或释放过程而受到影响。

为了验证药物的生物活性，研究人员将三个微机器人装载了33.3倍的LC50浓度的柔红霉素，并将每个装载的微机器人放入单独的含有100 μL FluoroBrite DMEM的试管中。每个试管被放置在44°C的水浴中1分钟，导致蜡融化并释放药物进入培养基。每个试管被移入含有细胞的孔中，并被培养72小时。使用PrestoBlue测量细胞的存活率，并与4PL模型进行比较。结果表明，微机器人释放的柔红霉素具有良好的生物活性，与未暴露的细胞相比，细胞存活率显著降低，这表明微机器人能够有效地将药物输送至目标细胞。

本研究的结论表明，一种完全集成的微机器人系统在体内环境中实现靶向药物输送具有巨大潜力。通过磁性引导和刺激响应释放，我们的研究解决了在动态体内环境中实现可靠和按需驱动的关键需求。本研究的微机器人设计包括3D打印的外壳、药物腔室、释放端口和顶部的悬浮网格；嵌入的微磁体；以及热敏的正二十烷蜡层。研究人员开发了一种集成的磁性驱动和机器人超声系统，以实现实时的微机器人运动和可视化，确保在微机器人穿越消化道后维持成像的聚焦状态。一旦到达目标位置，通过FUS系统进行的局部加热将触发微机器人药物负载的释放。这种蜡被选择和表征，其在体内环境下具有良好的生物相容性和在体温之上但接近的熔点；通过悬浮网格设计，它在体温下保持附着，并在加热至42°C时融化，从而触发药物释放。这一设计通过实验验证，能够将柔红霉素有效释放到细胞中，并在活体大鼠中首次展示了微机器人在体内环境中的局部加热和药物释放。

综上所述，这项研究突出了系统级集成的重要性，以实现可靠性能。尽管以往的研究展示了各个领域的进展，但整个流程的成功演示——从导航到在活体动物中触发释放——代表了重要的进步。微机器人平台为敏感生物治疗药物的有效局部输送提供了一种新方法，这可能有助于改善受IBD等疾病影响的患者的临床结果。