肠致病菌通过靶向ROCK通路逃逸上皮细胞挤压清除的新型免疫逃逸机制

《Nature》：Enteropathogenic bacteria evade ROCK-driven epithelial cell extrusion

本研究揭示了肠致病性大肠杆菌通过其泛素连接酶NleL靶向降解caspase-4和ROCK激酶，从而抑制感染肠上皮细胞的挤压清除。研究人员发现ROCK1/2是细胞挤压的关键介质，而NleL通过降解这些靶点帮助细菌在肠道定植。该发现为理解宿主-病原体相互作用提供了新视角，对开发抗感染策略具有重要意义。

　　

在人体肠道这个复杂的生态系统中，上皮细胞不仅构成物理屏障，还通过多种机制防御病原体入侵。其中，感染细胞的"挤压"现象尤为独特——受感染的肠上皮细胞(IECs)会被主动排出到肠腔中清除，这是一种重要的先天免疫防御机制。然而，狡猾的病原菌总能演化出对抗宿主防御的武器，这场永无休止的"军备竞赛"推动着双方共同进化。

以往研究已知，病原菌编码的毒力因子能够抑制细胞凋亡、焦亡(pyroptosis)或坏死性凋亡(necroptosis)等细胞死亡程序，但针对细胞挤压这一特殊防御机制的细菌对抗策略尚未明确。肠致病性大肠杆菌作为一种重要的肠道病原体，其如何逃逸宿主细胞的挤压清除，成为本研究的核心科学问题。

在这项发表于《Nature》杂志的研究中，科学家们发现大肠杆菌的泛素连接酶NleL能够抑制肠上皮细胞的挤压过程。通过大规模筛选63种大肠杆菌效应蛋白，研究团队发现NleL能够阻断LPS(脂多糖)诱导的细胞焦亡。进一步机制研究表明，NleL作为一种HECT样E3泛素连接酶，靶向caspase-4、ROCK1和ROCK2进行蛋白酶体降解，从而干扰宿主细胞的挤压清除机制。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过质谱分析鉴定NleL的底物蛋白；利用基因敲除技术构建ROCK1/2条件性敲除小鼠模型；采用肠道类器官培养系统研究细胞挤压过程；通过体外泛素化实验验证NleL与底物的直接相互作用；利用活细胞成像技术实时观察感染细胞的挤压动力学。所有动物实验均遵循相关伦理规范，并获得机构动物护理和使用委员会的批准。

NleL抑制LPS诱导的细胞焦亡

研究人员首先筛选了63种大肠杆菌效应蛋白，发现NleL能够显著抑制LPS诱导的细胞焦亡。表达NleL的细胞在LPS转染后存活率更高，乳酸脱氢酶(LDH)释放减少，表明细胞溶解性死亡受到抑制。重要的是，催化失活的NleL(C753A)无法发挥这种保护作用，说明NleL的泛素连接酶活性是其功能所必需的。

Caspase-4和ROCK是NleL的底物

通过质谱分析，研究团队发现caspase-4和ROCK2在NleL诱导后泛素化水平显著增加，蛋白总量下降。实验证实NleL直接与caspase-4、ROCK1和ROCK2结合，并在体外实验中验证了NleL能够催化这些蛋白的泛素化。蛋白酶体抑制剂能够阻止NleL引起的蛋白降解，证实了蛋白酶体降解途径的参与。

NleL靶向LPS感知CARD结构域

深入研究显示，NleL特异性地靶向caspase-4、caspase-5和caspase-11的CARD(caspase activation and recruitment domain)结构域，这一结构域负责感知细胞质内的LPS。将caspase-1的CARD替换为caspase-4的CARD后，caspase-1变得对NleL敏感，反之亦然，证明CARD结构域决定了NleL的底物特异性。

NleL靶向ROCK2的PH结构域

对于ROCK激酶，研究团队发现其C端的PH(pleckstrin homology)结构域是NleL识别和降解的关键区域。删除ROCK2的最后20个氨基酸或整个PH结构域都能使蛋白在NleL表达细胞中保持稳定。

NleL限制ROCK驱动的IEC挤压

在感染实验中，野生型EHEC(肠出血性大肠杆菌)感染导致caspase-4和ROCK2蛋白水平下降，而NleL缺陷菌株则无此效应。重要的是，NleL缺陷的Citrobacter rodentium(啮齿类柠檬酸杆菌)感染诱导了更多的IEC挤压，导致细菌在结肠中的定植减少。

遗传学实验进一步证实了ROCK激酶在细胞挤压中的关键作用。ROCK1/2缺陷的IEC单层细胞表现出FlaTox(鞭毛蛋白毒素)诱导的挤压减少。在动物实验中，IEC特异性Rock1/Rock2双敲除小鼠感染野生型Citrobacter后，结肠中细菌数量显著增加，表明ROCK缺陷削弱了宿主的防御能力。

本研究揭示了病原菌-宿主相互作用的新层面：肠致病菌通过NleL靶向降解ROCK激酶，从而抑制感染上皮细胞的挤压清除。这一发现不仅阐明了细菌逃逸宿主防御的新机制，也为理解细胞挤压这一特殊免疫清除过程的分子基础提供了重要线索。

从更广泛的视角来看，这项工作强调了宿主-病原体"军备竞赛"中一个此前未知的战场——细胞骨架重排驱动的感染细胞清除。通过靶向caspase-4和ROCK激酶，NleL为细菌提供了双重保险：既可能抑制LPS诱导的焦亡上游事件，又直接干扰细胞挤压所需的下游细胞骨架重构。

该研究的创新性在于首次发现细菌效应蛋白能够直接靶向细胞挤压机制，并将ROCK激酶确立为这一过程的关键介质。这些发现为开发针对肠道病原菌感染的新治疗策略提供了潜在靶点，同时也加深了我们对黏膜免疫中细胞清除机制的理解。