疟原虫在按蚊中肠发育的细胞图谱解析：关键转化期与互作机制研究

《Nature》：Mapping Plasmodium transitions and interactions in the Anopheles female

本研究通过单细胞RNA测序技术，首次绘制了恶性疟原虫在按蚊中肠发育关键瓶颈期的细胞图谱。研究人员系统解析了卵囊生长调控机制，发现PfATP4和PfLRS等靶点对卵囊发育至关重要，并揭示疟原虫优先与中肠祖细胞互作的上皮穿越新机制。该研究为阻断疟疾传播提供了新靶点。

　　

在热带地区的夜晚，一种致命的舞蹈正在悄然上演——疟原虫通过按蚊的叮咬在人类之间传播。这种微小寄生虫的生命周期中，最脆弱的环节恰恰发生在蚊子体内。当疟原虫随血液进入按蚊中肠后，大多数寄生虫都会死亡，只有极少数能够成功穿越中肠上皮，转化为卵囊并产生成千上万的感染性孢子体。这一过程是疟疾传播的关键，然而由于技术限制，科学家们对其中具体的分子机制知之甚少。

恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)作为最致命的疟原虫种类，每年导致数十万人死亡，其中大部分是撒哈拉以南非洲的儿童。尽管疟疾防治取得了进展，但传播阻断策略的开发仍面临挑战，主要是因为对蚊子体内寄生虫发育阶段的了解不足。传统的 rodent malaria models（啮齿类疟疾模型）虽然为研究提供了重要见解，但与人类疟原虫在按蚊中的发育存在显著差异。

为了解决这一知识空白，由哈佛大学陈曾熙公共卫生学院免疫与传染病学系领导的研究团队在《自然》杂志上发表了突破性研究成果。他们采用创新的双单细胞RNA测序技术，同时分析寄生虫和蚊子细胞的转录组，首次绘制了恶性疟原虫在按蚊中肠发育的完整细胞图谱。

研究的关键技术方法包括：建立优化的单细胞分离方案，对感染恶性疟原虫的冈比亚按蚊中肠细胞进行双单细胞RNA测序，涵盖36小时、2天、4天和7天四个时间点；整合已有数据集构建完整的寄生虫中肠发育图谱；通过药物干预实验验证关键靶点功能；利用条件性基因敲除系统研究转录因子功能；结合共聚焦显微镜技术验证细胞互作发现。

scRNA-seq of midgut and parasite cells

研究人员通过优化单细胞分离方案，成功从80只感染恶性疟原虫的冈比亚按蚊中肠中同时获取寄生虫和蚊子细胞。他们在四个关键时间点（36小时、2天、4天和7天）进行采样，覆盖了从动合子入侵到卵囊发育的主要阶段。通过深度测序和严格的质量控制，最终获得了3,495个高质量寄生虫细胞的转录组数据。

主成分分析显示，不同发育阶段的寄生虫呈现出明显的转录组差异。特别值得注意的是，研究人员还比较了在正常蚊子和蜕皮激素受体(EcR)敲低蚊子中发育的寄生虫，发现EcR信号通路受损会加速卵囊生长，这为研究后期发育阶段提供了更精细的分辨率。

Parasite atlas across all midgut stages

通过整合本研究数据与已有的单细胞RNA测序数据，研究团队构建了迄今为止最完整的疟原虫中肠发育图谱。该图谱识别出11个不同的寄生虫簇，包括配子/合子、血块中的动合子、入侵中的动合子、转化中的动合子(took)、新形成的卵囊、生长中的卵囊以及正在分割形成孢子体的卵囊。

伪时序分析揭示了一个清晰的发育轨迹，基因簇分析进一步识别出四个主要分支，分别对应不同的发育阶段和生物学过程。这些基因表达网络为了解寄生虫在中肠中的关键发育转变提供了宝贵信息。

Gene clusters unveil key transitions

研究人员通过基因簇分析发现了15个具有相似表达模式的基因簇，这些簇可分为四个主要分支。第一个分支包含与动合子成熟和运动相关的基因，如细胞骨架和肌球蛋白复合体基因。第二个分支主要涉及转录、表面重塑和粘附过程，表明在动合子-卵囊转化阶段发生了深刻的形态学变化。

最大的分支涵盖了从新形成卵囊到孢子体分割的整个生长过程，包括翻译、蛋白酶体活性和核糖核蛋白复合体相关基因。最后一个分支在正在分割的卵囊中高表达，特征是与孢子体形成相关的基因，包括核迁移、内膜复合体和入侵细胞器相关基因。

PfATP4 and PfLRS regulate oocyst growth

基于基因网络分析，研究人员选择了来自不同基因簇的候选靶点进行功能验证。PfATP4（一种Na⁺-ATP酶）和PfLRS（亮氨酸-tRNA连接酶）分别受到cipargamin(CIP)和MMV670325的抑制。通过给感染蚊子提供含药糖水，研究人员发现这两种药物虽然不影响卵囊数量和感染率，但显著抑制了卵囊生长。

缩短药物暴露时间（2-4天和2-7天）也产生了类似效果，表明钠离子外排的调节在卵囊生长早期至关重要。这种效应呈剂量依赖性，在多种蚊子-寄生虫组合中均得到验证，包括用斯氏按蚊感染柬埔寨野外分离株ART29，以及用冈比亚按蚊感染布基纳法索多克隆分离株P5。

PfSIP2 ensures hepatocyte infection

在最后一个基因分支中，研究人员发现了ApiAP2转录因子PfSIP2。通过构建条件性PfSIP2敲除(PfSIP2-cKD)株系，他们发现虽然PfSIP2敲除不影响卵囊强度、流行率、大小以及孢子体强度和流行率，但严重损害了孢子体入侵原代人肝细胞的能力，导致入侵效率降低67%，红细胞外期形式形成减少96%。

Parasites interact with progenitor cells

通过对蚊子细胞的数据分析，研究人员成功分析了55,789个高质量中肠细胞，识别出16个细胞簇，包括祖细胞、后肠上皮细胞、前肠上皮细胞、肠内分泌细胞、内脏肌肉细胞和贲门部细胞。在36小时时间点，他们发现了107个与蚊子细胞共享条形码的寄生虫（双读细胞），占总测序寄生虫的10.5%。

特别值得注意的是，双读细胞显著富集于肠干细胞/肠母细胞(ISC/EB)簇，尽管该簇仅占此时所有蚊子细胞的12.1%，但32.7%的双读细胞（占总寄生虫的3.3%）与祖细胞相关。共聚焦显微镜分析进一步证实了这一发现，显示10.1%的寄生虫似乎位于ISC/EB内部或与之密切接触。

Late oocysts are associated with muscles

与啮齿类疟原虫模型不同，研究人员没有发现祖细胞在晚期卵囊周围积累的证据。相反，他们通过共聚焦显微镜观察到内脏肌肉紧密包裹着晚期卵囊，肌肉纤维超出其正常宽度。这种相互作用在多种蚊子-寄生虫组合中均保守存在，表明肌肉细胞可能通过物理方式将卵囊锚定在中肠上，同时最大限度地减少上皮损伤。

研究结论表明，通过聚焦于以往难以研究的发展阶段，本研究全面重建了恶性疟原虫传播周期的关键事件。这些发现不仅扩展了预防寄生虫传播的潜在靶点库，还揭示了疟原虫与中肠祖细胞之间前所未有的相互作用。动合子穿越中肠上皮是一个异步过程，发生在24小时到36小时之间，而与祖细胞的相互作用可能发生在寄生虫到达基底侧并转化为卵囊的过程中。

研究人员提出，恶性疟原虫可能利用祖细胞作为中肠基底侧的标志物，祖细胞分裂过程中紧密连接的重塑可能促进寄生虫退出。与肌肉细胞的紧密关联可能是人类疟原虫与其特定传播媒介共同进化的结果，这种互作方式使得生长中的寄生虫能够以侵入性较小的方式被锚定。

这项研究的重要意义在于为疟疾传播阻断策略提供了新的分子靶点，包括PfATP4、PfLRS和PfSIP2等关键因子。这些靶点可用于开发基于蚊子的疟疾控制方法，如传播阻断药物和疫苗，或者蚊子靶向抗疟药。此外，研究揭示的细胞互作机制为理解疟原虫-媒介共同进化提供了新视角，对未来疟疾防控策略的设计具有重要指导意义。