茶多酚修饰乳铁蛋白复合物的特性及其对大肠杆菌的抗菌活性

《Journal of Dairy Science》：Characterization of tea polyphenol-modified lactoferrin complexes and their antimicrobial activity against Escherichia coli

研究乳铁蛋白（LF）与茶多酚（GA和EGCG）非共价结合形成的复合物对大肠杆菌的抗菌机制。通过UV、荧光、圆二色光谱及分子对接证实GA和EGCG通过氢键及疏水作用与LF结合，形成稳定复合物。MIC结果显示GA-LF复合物抗菌活性更强（MIC=2 mg/mL），EGCG-LF次之（MIC=2 mg/mL）。扫描电镜显示复合物破坏细菌细胞膜结构，结晶紫染色证实抑制生物膜形成。代谢组学分析表明复合物通过干扰能量代谢、蛋白质合成及运输系统抑制细菌生长，揭示协同作用机制。结论：LF与茶多酚复合可增强抗菌活性，为天然食品防腐剂开发提供依据。

　　本研究探讨了乳铁蛋白（Lactoferrin, LF）与两种茶多酚——没食子酸（Gallic Acid, GA）和表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin Gallate, EGCG）的非共价结合机制及其对大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌作用。LF作为一种天然存在的铁结合糖蛋白，具有多种生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗炎和免疫调节等。然而，由于抗生素的广泛使用，耐药性问题日益严重，因此寻找新型抗菌策略显得尤为重要。茶多酚作为天然的抗氧化剂和抗菌剂，因其结构中富含酚羟基和芳香环，具有良好的抗菌性能。本文通过结合LF与茶多酚，旨在开发一种具有协同抗菌作用的天然抗菌复合物，以应对日益严重的细菌耐药问题。

LF在哺乳动物的乳腺上皮细胞及黏膜分泌物中广泛存在，例如唾液、乳汁和胃肠道液，其中牛初乳中LF含量最高。LF具有多种生理功能，包括调节肠道菌群平衡、增强免疫力和抑制有害菌的生长。研究发现，LF可以通过与天然小分子物质的相互作用增强其生物活性。例如，LF与原花青素结合可以提高其泡沫性能，LF与绿原酸结合可增强其抗氧化和抗癌效果，而LF与壳聚糖-藻酸盐复合物则可增强其抗菌活性。这表明LF在与其他物质结合时，其功能可能得到进一步优化。

茶多酚是富含儿茶素类化合物的一类天然多酚，其主要成分占70%–80%。茶多酚具有良好的抗氧化活性，能够保护肠道健康、减少炎症反应，并且还具有天然的抑菌作用。它们可以通过改变细菌细胞膜的通透性、破坏其代谢功能等方式实现抗菌效果。已有研究表明，茶多酚可以与LF相互作用，如（-）-儿茶素-3-没食子酸（Epigallocatechin-3-gallate）和没食子酸单酯（Theaflavin monogallate）等，但其具体作用机制尚不明确。因此，本研究通过实验分析LF与GA和EGCG的结合情况，进一步探讨其抗菌作用。

在本研究中，GA和EGCG被选为具有优良抗菌性能的水溶性茶多酚，它们通过非共价相互作用与LF结合。通过紫外-可见光谱、荧光光谱、圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transform Infrared, FTIR）以及分子对接技术对LF-GA和LF-EGCG复合物进行了表征。实验结果显示，GA和EGCG主要通过氢键和疏水作用与LF结合，形成稳定的复合物。此外，CD光谱分析表明，GA和EGCG改变了LF的二级结构，使其从α-螺旋向β-折叠转变。FTIR光谱进一步验证了这种结构变化，表明氢键的形成导致了LF中羟基（-OH）的频率变化，而酰胺I带和酰胺II带的强度变化则反映了LF与GA和EGCG之间的相互作用强度。

分子对接分析显示，GA-LF复合物的结合能为-4.91 kcal/mol，而EGCG-LF复合物的结合能为-4.72 kcal/mol，说明GA-LF复合物的结合更为稳定。这一结果可能与GA分子较小、能够嵌入LF中的局部深腔有关。GA通过其单个酚羟基与LF中的赖氨酸（Lys-27）结合，而LF中的丙氨酸（Ala-31）、异亮氨酸（Ile-34）和脯氨酸（Pro-32）形成的疏水微环境有助于GA的结合。相比之下，EGCG具有更多的酚羟基和芳香环，能够通过氢键和疏水作用与LF的多个位点结合，因此其结合能力更强。EGCG的结合域位于LF的α-螺旋核心区域，其作用导致了LF结构的显著改变，这可能与其较强的抗菌活性有关。

在抗菌活性方面，实验测定了GA、EGCG和LF对大肠杆菌的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）。结果表明，GA的MIC为4 mg/mL，EGCG的MIC为2 mg/mL，而LF的MIC为10 mg/mL。进一步的协同抑制实验显示，GA-LF和EGCG-LF复合物的协同效应为加性效应，说明它们能够通过互补的机制增强抗菌效果。FIC值分别为1和2，表明GA-LF复合物的协同作用更为显著。这一结果可能与GA和EGCG在抑制细菌生长方面的不同作用机制有关，例如GA主要通过破坏细胞膜实现抗菌效果，而EGCG则可能通过干扰细菌的代谢和蛋白质合成发挥抑制作用。

扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）和结晶紫染色实验进一步揭示了LF-GA和LF-EGCG复合物对大肠杆菌的抑制机制。在SEM图像中，与对照组相比，处理后的细菌表面出现了明显的粗糙和皱缩现象，表明复合物对细菌细胞膜造成了破坏。结晶紫染色实验则显示，GA-LF和EGCG-LF复合物能够显著清除大肠杆菌的生物膜，其清除率分别达到94.43%和91.18%。这表明复合物不仅能够抑制细菌的生长，还能够破坏其生物膜结构，从而更有效地发挥抗菌作用。

代谢组学分析进一步揭示了LF-GA和LF-EGCG复合物对大肠杆菌代谢的影响。通过超高液相色谱-高分辨率质谱（Ultra-Performance Liquid Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometry, UPLC-HRMS）检测，共鉴定出37,986个离子峰，并筛选出具有显著差异的代谢物。分析结果显示，这些复合物能够显著改变大肠杆菌的代谢途径，包括能量代谢、物质合成、生物膜形成以及应激反应等。例如，GA-LF复合物主要影响芳香化合物代谢和能量相关途径，而EGCG-LF复合物则更多地干扰硫代谢和吲哚相关途径。这些代谢变化可能通过破坏细菌的代谢网络、抑制关键酶的合成以及干扰细胞膜结构等方式实现抗菌效果。

此外，代谢组学分析还揭示了不同浓度的复合物对大肠杆菌代谢物的影响。高剂量的GA-LF和EGCG-LF复合物对代谢物的干扰更为显著，可能通过多条代谢通路的协同作用实现更强的抗菌效果。而低剂量的复合物则主要影响基础代谢，例如阻止ABC转运蛋白的正常功能、干扰营养物质的摄入等，从而削弱细菌的生长能力。这些结果表明，LF与茶多酚的结合不仅能够增强其抗菌活性，还可能通过多种机制干扰细菌的生理功能。

KEGG通路富集分析进一步揭示了LF-TP复合物对大肠杆菌代谢的影响。结果显示，这些复合物主要干扰了大肠杆菌的核心代谢网络，包括能量代谢、物质运输、蛋白质合成以及应激反应等。例如，GA-LF复合物可能通过破坏中心碳代谢和辅酶A（CoA）的合成，抑制细菌的生长。而EGCG-LF复合物则可能通过影响硫代谢和吲哚相关通路，导致更复杂的应激反应。这些通路的改变可能为优化抗菌剂组合提供了理论依据。

综上所述，本研究通过多种实验方法验证了LF与GA和EGCG的结合能力及其对大肠杆菌的抗菌作用。结果显示，LF与茶多酚的结合主要通过非共价作用，包括氢键和疏水作用，形成稳定的复合物。这些复合物不仅能够有效抑制大肠杆菌的生长，还能够破坏其细胞膜结构和代谢功能，从而实现更全面的抗菌效果。代谢组学分析进一步揭示了复合物对细菌代谢途径的干扰，为理解其抗菌机制提供了新的视角。此外，研究还指出，LF-TP复合物可能在食品保鲜和抗菌剂开发中具有重要应用价值。然而，未来还需要进一步研究其在真实食品体系中的效果，评估其对感官特性的影响，并确定其在体内的安全性，以便更好地应用于实际生产中。