胶原蛋白结合型IL-12增强STEAP1 CAR-T细胞治疗前列腺癌：降低毒性并克服免疫抑制微环境

《Nature Biomedical Engineering》：Collagen-binding IL-12-armoured STEAP1 CAR-T cells reduce toxicity and treat prostate cancer in mouse models

本研究针对CAR-T细胞治疗实体瘤面临的免疫抑制微环境、免疫细胞浸润不足和抗原异质性等挑战，开发了胶原蛋白结合结构域融合的IL-12(CBD-IL-12)装甲的STEAP1 CAR-T细胞。研究表明，CBD-IL-12能特异性滞留于肿瘤组织，提高瘤内IFN-γ水平，同时降低肝毒性和非靶器官T细胞浸润。该疗法激活先天和适应性免疫，识别多种肿瘤抗原，与免疫检查点抑制剂联用可消除小鼠模型中大型前列腺肿瘤。人源CBD-IL-12装甲CAR-T在22Rv1异种移植模型中显示强大抗肿瘤效力，且循环IL-12水平低于未修饰IL-12装甲CAR-T，为实体瘤CAR-T治疗的临床转化提供了新策略。

　　

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，尤其是转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)目前仍难以治愈，患者中位总生存期仅约3年。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得了显著成功，但在实体瘤治疗中面临诸多挑战，包括免疫抑制性肿瘤微环境(TME)、免疫细胞浸润不足以及肿瘤抗原异质性等。

为解决这些难题，研究人员将目光投向了白细胞介素12(IL-12)，这是一种能够重塑免疫抑制性"冷"肿瘤微环境的细胞因子。IL-12是干扰素γ(IFN-γ)的有效诱导剂，能促进T细胞、自然杀伤(NK)细胞向肿瘤的迁移和浸润，并增强其细胞毒性能力。然而，IL-12的临床应用受到剂量限制性免疫相关不良事件(irAEs)的阻碍，特别是肝毒性问题。

先前的研究尝试利用肿瘤反应性T细胞迁移到肿瘤组织的能力来递送IL-12。核因子激活T细胞(NFAT)响应性启动子使工程化T细胞能够在识别肿瘤抗原时表达有效载荷(即抗肿瘤生物制剂)，从而限制有效载荷的系统性浓度。NFAT启动子驱动的IL-12诱导表达据报道比其组成型表达更安全。然而，在一项I期试验中，接受≥3亿个NFAT-IL-12装备的肿瘤浸润淋巴细胞的转移性黑色素瘤患者中有50%出现3级或4级肝毒性，这阻碍了其进一步发展。

本研究团队此前发现，静脉注射的冯·维勒布兰德因子(vWF)A3胶原蛋白结合结构域(CBD)能有效在肿瘤中积累，这是由于肿瘤特异性胶原可及性所致。静脉注射CBD-IL-12与未修饰的IL-12相比，能诱导瘤内IFN-γ水平持久升高。CBD与IL-12融合显著降低了肝损伤标志物丙氨酸转氨酶(ALT)活性和血清IFN-γ。

研究人员最近鉴定了一个有前景的肿瘤相关抗原——六跨膜前列腺上皮抗原1(STEAP1)，在mCRPC中的表达比前列腺特异性膜抗原更广泛。他们开发了针对人STEAP1(hSTEAP1)的第二代CAR-T细胞，在多种小鼠前列腺癌模型中显示出显著但非治愈性的疗效。静脉注射的CBD-IL-12蛋白和STEAP1 CAR-T细胞协同作用，延长了前列腺癌小鼠的生存期。

在本研究中，研究人员进一步改造STEAP1 CAR-T细胞，使其在识别STEAP1时表达CBD-IL-12，以增强肿瘤特异性免疫反应。他们假设将CBD作为货物融合到IL-12上，可以降低与未修饰IL-12装甲T细胞相关的系统性毒性。

主要技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先通过蛋白质工程构建了不同CBD融合位点的单链(sc)小鼠IL-12变体；利用γ-逆转录病毒载体实现hSTEAP1 CAR的组成型表达和NFAT驱动的IL-12变体表达；通过流式细胞术评估CAR表达和细胞表型；使用钙黄绿素-AM释放法测定体外细胞毒性；通过酶联免疫吸附试验(ELISA)定量细胞因子水平；建立小鼠前列腺癌模型评估体内抗肿瘤效果；利用空间转录组学分析肿瘤微环境变化；通过免疫组织化学检测组织浸润情况。

研究结果

CBD-IL-12装甲STEAP1 CAR-T细胞在体外有效杀伤癌细胞

研究人员设计了具有不同CBD融合位点的单链小鼠IL-12变体，所有这些变体都显示出强大的半数最大有效浓度(EC₅₀)值。他们接下来设计了γ-逆转录病毒载体，用于hSTEAP1小鼠CAR的组成型表达和IL-12变体的NFAT驱动表达。

所有STEAP1 CAR-T变体都能裂解RM9-hSTEAP1-萤火虫荧光素酶(Fluc)小鼠前列腺癌细胞，但不能裂解RM9野生型(WT)细胞。IL-12变体的表达显著增强了对RM9-hSTEAP1细胞的细胞毒性，表明自分泌IL-12有助于增强细胞溶解能力。装甲有一个CBD融合到IL-12(CBD-IL-12或IL-12-CBD)的CAR-T细胞在刺激时分泌有效载荷，但分泌的CBD-IL-12-CBD量较低。尽管如此，所有装甲的CAR-T细胞都显示出增强的IFN-γ产生。

CBD-IL-12装甲hSTEAP1 CAR-T细胞无需预 conditioning 即展示抗肿瘤疗效

研究人员测试了常规hSTEAP1 CAR-T细胞对皮下RM9-hSTEAP1-Fluc肿瘤的治疗效果。如先前报道，hSTEAP1 CAR-T细胞显示出显著的抗肿瘤效果，但未观察到完全缓解(CR)。接下来，他们用胶原结合IL-12装甲的CAR构建体处理相同的肿瘤模型。所有装甲的CAR-T治疗都明显延迟了肿瘤生长，并延长了生存期。用CBD-IL-12装甲CAR-T细胞治疗的五只小鼠中有一只显示CR，用IL-12-CBD CAR-T细胞治疗的六只小鼠中有两只显示CR，而用CBD-IL-12-CBD CAR-T细胞治疗的小鼠中没有肿瘤被根除。未观察到体重减轻。用CBD-IL-12或IL-12-CBD CAR-T细胞治疗的小鼠在第11天血清IFN-γ水平有短暂且无统计学显著意义的增加趋势。CBD-IL-12-CBD CAR-T治疗没有增加血清IFN-γ水平，与CBD-IL-12-CBD表达不良一致。

CAR-T细胞介导的CBD-IL-12递送平衡治疗效果和安全性

研究人员选择N端融合CBD-IL-12装甲CAR-T细胞与IL-12装甲CAR-T细胞进行详细比较，因为N端和C端融合在体外和体内具有相似特性。CBD与IL-12融合显著降低了治疗小鼠的血清IFN-γ水平。未观察到体重减轻。尽管无统计学显著性，但IL-12 CAR-T细胞与CBD-IL-12 CAR-T细胞相比显示出更强的抗肿瘤效果。CBD(人源)的免疫原性可能干扰了CBD-IL-12 CAR-T在免疫活性小鼠模型中的长期治疗效果，因为他们在血浆中检测到抗CBD-IL-12 IgG。

接下来，研究人员比较了CBD-IL-12 hSTEAP1 CAR-T细胞与hSTEAP1 CAR-T细胞和CBD-IL-12蛋白联合疗法的治疗效果。CBD-IL-12 CAR-T细胞的单药治疗优于联合治疗，显示出80%的CR率。这表明CAR-T细胞介导的、局部和持续的有效载荷递送到肿瘤微环境比单次大剂量蛋白更有效。

为了研究CBD-IL-12 CAR-T细胞是否对hSTEAP1和其他抗原产生了抗肿瘤免疫记忆，研究人员用RM9-hSTEAP1或亲本RM9 WT细胞(hSTEAP1阴性)再次攻击完全缓解的小鼠。所有长期存活的小鼠都拒绝了第二次RM9-hSTEAP1攻击，证明了对hSTEAP1的抗肿瘤免疫记忆。RM9 WT肿瘤在植入完全缓解的小鼠时也受到抑制，先前用CBD-IL-12 CAR-T细胞治疗的存活小鼠显示出40%的排斥率。结果表明CBD-IL-12 CAR-T细胞诱导抗原扩散以对抗抗原异质性。

分泌的CBD-IL-12显示增强的肿瘤定位

研究人员量化了体内CAR-T细胞分泌的IL-12和CBD-IL-12。在没有给予IL-12装甲CAR-T细胞的情况下，肿瘤中几乎检测不到IL-12。在第8天，用CBD-IL-12 CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤内检测到显著更高水平的IL-12。相比之下，在第8天，CBD-IL-12 CAR-T治疗的小鼠血清IL-12浓度显著较低。在第6天，从CBD-IL-12 CAR-T治疗小鼠脾脏检测到的IL-12显著减少。两组从肺部检测到的IL-12水平相当。心脏、肝脏和肾脏中几乎检测不到IL-12。

鉴于在免疫活性模型中检测到的血清IL-12浓度较低，研究人员接下来使用NSG小鼠量化CAR-T衍生的IL-12，其中消耗IL-12的内源性免疫细胞很少。携带MyC-CaP-hSTEAP1的雄性NSG小鼠静脉接受C57BL6/J来源的CAR-T细胞。CBD-IL-12 CAR-T细胞和IL-12 CAR-T细胞都显示出抗肿瘤效果。重要的是，血清CBD-IL-12水平显著低于血清IL-12水平。这些结果表明，与IL-12相比，从CAR-T细胞分泌的CBD-IL-12显著更局限于肿瘤，并且较少分布到身体其他部位。

CBD-IL-12 CAR-T治疗降低系统性毒性

免疫相关不良事件(irAEs)是IL-12疗法临床转化的主要障碍之一。肝毒性是接受系统性重组人IL-12给药患者的常见副作用。IL-12 CAR-T细胞显著增加了肝损伤相关ALT和碱性磷酸酶(ALP)的血清浓度，但CBD-IL-12 CAR-T细胞没有。

与CAR-T细胞相比，IL-12 CAR-T细胞显著促进了CD3⁺ T细胞向非靶器官(肝、肺和肾)的浸润，而CBD-IL-12 CAR-T细胞则没有。在任何治疗组的器官苏木精-伊红(H&E)染色中未发现结构异常。这些结果表明，CBD与IL-12融合降低了IL-12装甲CAR-T细胞的毒性。

CBD-IL-12 CAR-T细胞使肿瘤发炎并诱导抗肿瘤免疫浸润

肿瘤细胞异质性是CAR-T细胞复发和无效的主要原因。研究人员在一些动物中观察到完全缓解，以及部分完全缓解小鼠对RM9 WT再攻击的排斥，表明CBD-IL-12 CAR-T细胞诱导抗原扩散。他们分析了肿瘤微环境以研究潜在机制。IL-12诱导的IFN-γ通过上调关键蛋白(如MHC-I)的表达促进交叉呈递。CXCL9将T细胞和NK细胞招募到肿瘤微环境中。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)也由IL-12诱导，促进具有T细胞介导的抗肿瘤免疫主要作用的交叉呈递树突状细胞(DCs)的成熟。

研究人员发现，与未转导(UTD)和未装甲CAR-T细胞相比，IL-12 CAR-T细胞和CBD-IL-12 CAR-T细胞上调了瘤内IFN-γ、CXCL9和GM-CSF。他们还通过流式细胞术表征了RM9-hSTEAP1肿瘤中的免疫细胞浸润。与瘤内CXCL9增加一致，CBD-IL-12 CAR-T细胞与CAR-T细胞相比增加了CD45⁺白细胞、CD3⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和CD3^-NK1.1⁺ NK细胞的频率，并且增加的频率与较低的肿瘤负荷相关。CBD-IL-12 CAR-T细胞在CD11c⁺MHC-II⁺ cDC群体中增加了交叉呈递的常规1型树突状细胞(cDC1s)，包括CD103⁺ cDC1s和CD8α⁺ cDC1s，与GM-CSF增加一致。CBD-IL-12 CAR-T细胞显著增加了中性粒细胞的频率，中性粒细胞在过继转移抗原特异性T细胞后消除抗原阴性癌细胞中起关键作用。CBD-IL-12 CAR-T细胞显著减少了CD11b⁺Ly6C^hiLy6G^-单核细胞性髓源性抑制细胞(M-MDSCs)，这是MDSCs的一个特别具有抑制性的亚群，并且M-MDSC频率与肿瘤负荷正相关。来自用CBD-IL-12 CAR-T细胞治疗的小鼠的脾脏T细胞与RM9 WT共培养时产生显著更高量的IFN-γ，表明对hSTEAP1以外抗原的T细胞反应。总之，CBD-IL-12 CAR-T细胞改变了肿瘤中免疫浸润的组成，使其朝向抗肿瘤状态，诱导抗原扩散以对抗前列腺癌的异质性。

CBD-IL-12 CAR-T细胞重塑瘤内转录景观以增强抗肿瘤免疫

CAR-T细胞在实体瘤中的有限运输和浸润以及免疫抑制性肿瘤微环境是当前疗法疗效的主要挑战。研究人员进行了空间转录组学分析，以评估整个肿瘤微环境是否可以被CBD-IL-12 CAR-T细胞重塑。他们观察到CD45⁺白细胞在整个组织中的浸润以及IL-12 CAR-T或CBD-IL-12 CAR-T处理样本中肿瘤区域(泛细胞角蛋白+)的减少。免疫组织化学(IHC)染色证实了装甲CAR-T处理肿瘤中CD3⁺ T细胞浸润增强。

主成分分析(PCA)显示，用三种不同疗法处理的肿瘤组织表现出明显不同的特征。基因集富集分析表明，CBD-IL-12 CAR-T细胞激活了IL-12通路，并通过MHC-I激活了抗原加工和呈递。IL-12通路基因的富集无统计学显著性(P=0.059)，可能是因为数据集中只有17个基因被注释到该通路。事实上，Fisher精确检验显示差异表达基因中IL-12通路富集具有统计学显著性(P=0.01241)。

由于研究人员观察到IL-12 CAR-T细胞和CBD-IL-12 CAR-T细胞处理肿瘤中B细胞增加的趋势，他们分析了与三级淋巴结构(TLS)相关的基因表达变化。他们观察到在CBD-IL-12 CAR-T和IL-12 CAR-T处理的肿瘤中，各种TLS相关趋化因子和趋化因子受体的表达增加，包括Cxcr4、Cxcr5、Cxcl12和Cxcl13。有趣的是，CBD-IL-12 CAR-T细胞明显上调了Bcl6(T滤泡辅助细胞的主调节因子)和Aicda(类别转换重组和体细胞超突变所必需的)，而IL-12 CAR-T细胞则没有。与Bcl6上调一致，Prdm1(浆细胞的主调节因子，已知与Bcl6相互调节)被CBD-IL-12 CAR-T细胞下调。这些数据表明CBD-IL-12 CAR-T细胞增强了瘤内免疫聚集体的成熟和功能，这些聚集体类似于TLS。研究人员还观察到在CBD-IL-12 CAR-T处理的肿瘤中，共刺激分子如Cd80、Cd86、Cd40和Tnfsf4的特异性富集。这些共刺激信号可能促进局部T细胞启动和免疫突触形成，从而增强抗肿瘤免疫。总之，数据表明CBD-IL-12 CAR-T细胞将肿瘤微环境重编程为更具免疫活性、支持TLS的生态位。

CBD-IL-12 CAR-T细胞联合免疫检查点抑制剂(CPIs)根除大型已建立RM9-hSTEAP1肿瘤

由于CBD-IL-12 CAR-T细胞单独治疗不能持续诱导无肿瘤完全缓解，并且肿瘤浸润T/NK细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)表达升高，研究人员检查了CBD-IL-12 CAR-T细胞、抗PD-1和抗CTLA-4免疫检查点抑制剂组合的抗肿瘤效果。

当肿瘤体积约为60 mm³时，装甲CAR-T细胞与CPIs联合实现了100%的完全缓解率。即使他们将初始CAR-T治疗延迟到第6天(肿瘤体积约为120 mm³)，CBD-IL-12 CAR-T细胞+CPIs治愈了80%的RM9-hSTEAP1荷瘤小鼠，并显著延长了其生存期，与CAR-T细胞+CPIs相比。这些数据显示了联合免疫疗法对大型已建立肿瘤的强大抗肿瘤效果。所有无肿瘤存活的小鼠都拒绝了皮下再攻击的RM9-hSTEAP1细胞。所有治疗均未导致动物体重减轻。先前使用IFN-γ受体敲除(KO)小鼠的研究表明，IL-12诱导的IFN-γ在免疫相关不良事件中起核心作用。在本研究中，用IL-12 CAR-T+CPIs治疗的小鼠观察到血清IFN-γ显著增加，但用CBD-IL-12 CAR-T+CPIs治疗的小鼠没有，与CAR-T单药治疗的毒性评估一致。

完全人源化CBD-IL-12 CAR-T细胞抑制人前列腺癌异种移植瘤并最小化循环IL-12

在确认未修饰和CBD融合的人IL-12(CBD-hIL-12)蛋白可以重组表达后，研究人员生成了用于人T细胞的慢病毒载体。他们用hSTEAP1-hBBζ+NFAT-CBD-hIL-12载体成功转导了Jurkat细胞和原代人T细胞。人CBD-hIL-12 CAR-T细胞和hIL-12 CAR-T细胞在与hSTEAP1⁺ 22Rv1人前列腺癌细胞共培养时显示出增强的hIL-12表达。这些hIL-12装甲CAR-T细胞对22Rv1显示出更好的体外杀伤效果，而不杀伤22Rv1 hSTEAP1 KO细胞。

最后，研究人员在皮下和播散性转移22Rv1肿瘤模型中评估了人装甲CAR-T细胞。STEAP1 CAR-T细胞无法控制皮下肿瘤生长。相比之下，hIL-12 CAR-T细胞和CBD-hIL-12 CAR-T细胞都诱导了肿瘤消退并延长了生存期。显著的是，在所有测试时间点，CBD-hIL-12的血清浓度比IL-12低10倍以上。未观察到体重减轻。与皮下模型一致，系列生物发光成像(BLI)证明，在22Rv1播散性肿瘤模型中，hIL-12 CAR-T细胞和CBD-hIL-12 CAR-T细胞与CAR-T细胞相比表现出优异的抗肿瘤效果。CBD与hIL-12融合显著降低了血清IL-12水平。总之，这些结果表明CBD-IL-12表达平台技术适用于人T细胞。

研究结论与意义

本研究展示了一种蛋白质工程方法，使IL-12与CAR-T疗法联用更安全。研究人员先前报道，第二代STEAP1 CAR-T细胞诱导肿瘤消退，但面临STEAP1抗原丢失导致的复发。这可以通过与强效细胞因子(如IL-12)联合来克服，IL-12将有效激活宿主免疫系统。他们之前报道，将vWF衍生的CBD与免疫检查点抑制剂抗体(PD-L1、CTLA-4)、细胞因子(IL-2和IL-12)、趋化因子CCL4或血清白蛋白结合，改善了它们向肿瘤基质的定位，增强了治疗效果并减少了副作用。

使用这种结合蛋白质工程和细胞工程的药物递送方法，从CAR-T细胞表达CBD-IL-12显示出比仅仅将CAR-T与CBD-IL-12蛋白联合更强的抗肿瘤效果，可能是由于CBD-IL-12的局部和持续生产。来自这种新型CAR-T细胞疗法的CBD-IL-12表达通过靶向细胞外基质，提高了CAR-T细胞对抗小鼠和人前列腺癌模型的效力。与未修饰的IL-12相比，CBD融合增强了来自CAR-T有效载荷的IL-12的瘤内滞留，并减少了系统性IL-12暴露，降低了免疫相关不良事件。表达IL-12的过继性T细胞疗法的免疫相关不良事件是临床试验失败的主要原因。CBD-IL-12的肿瘤归巢能力可能有助于降低毒性，即使CBD-IL-12是从健康组织中的CAR-T细胞分泌的，这是由于NFAT响应性启动子和/或无关组织中低水平STEAP1表达的泄漏性。数据表明，CBD与IL