人类植入前胚胎晚期活体成像揭示有丝分裂错误的新发机制及其对非整倍体检测的临床启示

《Nature Biotechnology》：Live imaging of late-stage preimplantation human embryos reveals de novo mitotic errors

本研究通过优化mRNA电转核标记技术结合光片活体成像，首次在人类囊胚期观察到新发的染色体分离错误（包括多极纺锤体形成、滞后染色体和分裂滑移等），并开发了开源半自动分割方法追踪细胞命运。研究发现多数错误发生于胎盘前体细胞且细胞仍可存活增殖，这对植入前遗传学非整倍体检测（PGT-A）的临床价值提出重要质疑，同时为研究胚胎发育提供了突破性技术平台。

　　

优化核标记与成像技术突破研究瓶颈

现有染色体分离错误成像方法不适用于研究晚期植入前人类胚胎。为解决这一技术难题，研究团队系统比较了慢病毒、腺相关病毒（AAV）、杆状病毒（BacMam）、DNA染料和mRNA电转等多种标记方法在小鼠胚胎中的效果。结果显示病毒载体存在表达沉默或持续时间短的问题，而DNA染料仅能标记滋养外胚层（trophectoderm）细胞。最终确定最佳方案为使用700-800 ng/μl浓度的H2B-mCherry mRNA电转，该方法对小鼠和人类囊胚阶段的标记效率分别达到75%和41%，且不影响胚胎发育进程和谱系特异性标志物CDX2（滋养外胚层）与NANOG（上胚层）的表达。

研究采用LS2光片显微镜（light-sheet microscopy）进行长期活体成像，该技术通过双照明和双检测系统最大限度减少光毒性，可持续成像达46小时。验证实验证实光片成像不会影响小鼠胚胎从腔化开始到孵化过程的发育时序。

物种间细胞周期动力学差异揭示人类胚胎发育特点

通过活体成像精确量化有丝分裂各阶段持续时间，研究发现人类与小鼠囊胚期细胞在有丝分裂时长上无显著差异：人类胚胎壁层（mural）和极层（polar）滋养外胚层细胞平均有丝分裂时长分别为51.09±11.11分钟和52.64±9.13分钟，小鼠则为49.95±8.68分钟和49.90±8.32分钟。然而，人类胚胎细胞间期（interphase）显著长于小鼠：人类壁层和极层细胞平均间期分别为18.10±3.82小时和18.96±4.15小时，而小鼠仅11.33±3.14小时和10.51±2.03小时。这一发现提示间期时长差异是导致物种间植入前发育速度不同的关键因素。

囊胚阶段新发染色体分离错误的动态观察

研究团队系统分析了13个人类囊胚（223次细胞分裂）和17个小鼠囊胚（255次细胞分裂）的染色体分离过程。在人类囊胚中，90%的细胞在分裂前期显示染色体正常排列，8%存在排列错误，而小鼠分别为95%和4%。研究发现的具体错误类型包括：

滞后染色体（lagging chromosomes）和微核（micronuclei）形成：这些异常仅在有丝分裂过程中被观察到，排除间期核碎裂的可能性。多数滞后染色体导致微核形成，且这些细胞在后续分裂中仍保持活力。

分裂滑移（mitotic slippage）：在人类囊胚中观察到2例罕见现象，细胞在经历有丝分裂延迟后未进行染色体分离即退出分裂，直接进入G1期成为四倍体细胞。小鼠囊胚中也发现3例类似事件。

多极分裂（multipolar division）：在人类囊胚中观察到2次三极纺锤体形成，产生三个子细胞。尽管无法完全排除多个核位于同一细胞内的可能性，但核迁移模式支持它们分离到不同细胞中。

微核的命运：被动继承与再整合

研究首次通过长期活体成像追踪微核在胚胎中的命运。结果显示，大多数微核（人类89%，小鼠93%）在胞质中保持独立，不与主核融合，并在后续分裂中被被动继承给其中一个子细胞。值得注意的是，11%的人类囊胚和7%的小鼠囊胚中观察到微核再整合（reintegration）现象，提示胚胎可能存在基因组不稳定性纠正机制。免疫荧光分析证实，在常规培养（非光片成像）的胚胎中同样存在微核，且携带微核的细胞不仅保持活力，还能继续增殖。

半自动分割追踪技术揭示滋养外胚层细胞命运限制

为追踪单个核的命运，研究团队开发了基于StarDist-3D深度学习模型的半自动分割方法，该模型针对胚胎大小、形状和信号变异性进行优化，并结合正则化高斯混合最优传输（regularized Gaussian mixture optimal transport）进行自动追踪。通过该方法分析人类囊胚期标记细胞发现，大多数外部滋养外胚层细胞保持外部位置，产生更多滋养外胚层后代，显示命运限制。仅在一个胚胎中观察到单个外部细胞在分裂后一个子细胞向内迁移的现象。对核方向和分裂角度的分析显示，人类胚胎中核倾向于切向而非径向排列（Kolmogorov-Smirnov检验P<10^-300），细胞分裂也显著偏向切向（P<10^-9），提示组织几何形态可能通过影响核取向和分裂方向参与维持滋养外胚层结构。

研究意义与临床启示

该研究建立的技术平台首次实现人类囊胚期长达46小时的持续活体成像，远超此前旋转盘显微镜（spinning disk microscopy）的12小时记录。研究发现的新发有丝分裂错误（特别是局限于滋养外胚层的错误）对广泛应用的植入前遗传学非整倍体检测（PGT-A）的临床价值提出根本性质疑，因为该技术假设检测到的非整倍体源于早期错误，而研究证明晚期仍可能发生局限于滋养层的错误，这些错误可能不影响内细胞团（inner cell mass）。此外，人类滋养外胚层细胞在囊胚期显示命运限制，但观察到的罕见内化事件与近期关于人类极区滋养外胚层多層化（multilayering）的研究一致，需进一步通过基因表达表征确认内化细胞的谱系属性。

该研究提供的核标记、活体成像和分割方法为在敏感发育背景下研究多样化细胞结构奠定基础，未来可应用于探索人类胚胎更广泛的发育过程。