保留时间对齐与缺失值填补算法对比较蛋白质组学实验中统计学比较的影响

《Journal of Proteome Research》：Designing a Comparative Proteomics Experiment: Retention-Time Alignment and Imputation Algorithms Affect Statistical Comparisons between Samples

本刊推荐：针对比较蛋白质组学实验中因样品共分析导致的统计偏差问题，研究人员开展了关于保留时间对齐（retention-time alignment）与缺失值填补（imputation）算法影响的研究。通过分别与合并搜索样品数据的对比分析，发现合并搜索虽增加鉴定数量，但会引起假性转移（false transfers）并改变蛋白质丰度、差异表达蛋白及置信度评分。该研究发表于《Journal of Proteome Research》，强调了实验设计对生物标志物鉴定可靠性的关键影响。

　　

在生命科学领域，比较蛋白质组学（comparative proteomics）已成为发现疾病生物标志物和揭示分子机制的重要工具。通过比较不同生理或病理状态下样品中蛋白质表达的差异，研究人员能够识别出与特定条件相关的关键蛋白质。然而，这一过程并非一帆风顺。蛋白质组学工作流程复杂，从样品制备、液相色谱分离到质谱检测，每一步都可能引入变异。这些变异使得在不同样品间进行可靠的比较变得极具挑战性。

为了应对这些挑战，现代蛋白质组学数据分析软件，如Progenesis Qi for proteomics，内置了多种算法来校正实验中的不一致性。其中，保留时间对齐（retention-time alignment）算法旨在校正由于液相色谱系统不稳定导致的肽段洗脱时间偏移，确保不同样品中相同的肽段能够被正确匹配。另一方面，缺失值填补（imputation）算法则用于处理常见的数据缺失问题，即某个蛋白质在某些样品中被检测到，而在另一些样品中却未被检测到（缺失值）。这些算法通过估算缺失的丰度值，使得后续的统计学分析能够进行。

尽管这些算法极大地便利了数据处理并提高了定量分析的效率，但它们也可能带来意想不到的后果。一个核心的疑问浮出水面：当将不同的实验样品合并在一起进行数据库搜索时，这些旨在“修正”数据的算法，是否会系统性地改变最终的统计学比较结果，从而影响生物标志物发现的准确性？这正是由Jessica M. Conforti、Constantine C. Breus和Elyssia S. Gallagher组成的研究团队试图解答的问题。他们质疑，合并搜索策略下，对齐和填补算法可能会模糊样品间的真实生物学差异，甚至引入人为的假象。

为了验证这一假设，研究团队设计了一项严谨的分析。他们利用了两组数据：一组是比较不同样品前处理方法（sample-cleanup methods）的数据集，另一组是单蛋白质样品的数据。关键的设计在于，他们将每组数据分别以两种方式进行数据库搜索：一是将各个样品单独进行搜索（separately），二是将所有样品合并在一起进行搜索（together），均使用Progenesis Qi软件。通过系统比较两种搜索策略下的结果差异，他们旨在揭示保留时间对齐和缺失值填补算法对下游分析产生的具体影响。

本研究主要依赖于比较蛋白质组学的核心分析流程。研究人员利用Progenesis Qi for proteomics软件进行数据库搜索，核心环节包括保留时间对齐以校正色谱偏移，以及缺失值填补以处理未检测到的蛋白质丰度。分析对象为公开可用的样本前处理方法比较数据集（MSV000094130）和单蛋白质样品数据。通过对比单独搜索与合并搜索的策略，评估算法对蛋白质鉴定数、样品间相似性、蛋白质丰度、差异表达蛋白筛选及置信度评分的影响。所有再分析数据已存放于MassIVE（MSV000096112）和ProteomeXchange（PXD056868）数据库。

Searching Samples Together Increases the Number of Identifications in Each Sample

研究结果表明，与单独搜索每个样品相比，将所有样品合并在一起进行搜索显著增加了每个样品中鉴定到的蛋白质数量。这表明合并搜索策略能够利用更多样品的信息，可能提高了低丰度肽段的鉴定效率。然而，这种数量的增加是否完全代表真实的生物学发现，还是包含了算法引入的噪声，需要进一步审视。

Searching Samples Together Enhances the Protein Similarity Between Samples and Leads to False Transfers

一个更为关键的发现是，合并搜索增强了不同样品之间的蛋白质相似性。具体而言，它导致了“假性转移（false transfers）”现象。这意味着，原本只存在于某一个或某几个样品中的蛋白质，在合并搜索并经过算法处理后，可能会被错误地“分配”或“填补”到其他原本并不存在该蛋白质的样品中。这种人为的均一化效应，会掩盖样品间真实的生物学异质性。

Searching Samples Together Affects Protein Abundance, Differentially Expressed Proteins, and Confidence Scores

进一步的分析揭示，搜索策略深刻地影响着定量的核心结果。首先，蛋白质的丰度（protein abundance）估计值在合并搜索和单独搜索之间出现了差异。其次，基于这些丰度值进行统计学检验（如t检验）所筛选出的差异表达蛋白质（differentially expressed proteins）列表也发生了改变——一些在单独搜索下显著的蛋白质在合并搜索下变得不显著，反之亦然。最后，与蛋白质鉴定和定量相关的置信度评分（confidence scores）也受到了影响。这些变化归根结底源于保留时间对齐和缺失值填补算法在处理合并数据集时的全局性调整。

本研究通过严谨的实验设计揭示了蛋白质组学数据分析中一个容易被忽视但至关重要的问题。研究人员得出结论，在比较蛋白质组学实验中，选择将样品单独搜索还是合并搜索，并非一个无关紧要的技术细节，而是一个会直接影响最终生物学结论的关键实验设计因素。Progenesis Qi等软件中的保留时间对齐和缺失值填补算法在合并搜索时，虽然提升了数据处理效率并增加了表观的鉴定数量，但其代价可能是引入系统性偏差，包括假性转移、扭曲真实的蛋白质丰度、改变差异表达蛋白的列表以及影响置信度评估。

这项研究的意义重大。它向所有从事比较蛋白质组学研究的人员发出了警示：必须审慎考虑数据库搜索的设计策略。盲目依赖合并搜索带来的“便利”和“数据量提升”可能适得其反，导致对生物标志物的错误识别或漏判。对于旨在发现可靠疾病标志物的研究而言，确保数据分析流程能够真实反映生物学差异至关重要。因此，研究人员建议，在进行关键的比较分析时，应评估不同搜索策略对结果稳定性的影响，甚至考虑将单独搜索作为验证合并搜索结果的一种方式。最终，这项由Conforti等人完成的工作强调，精细化的实验设计是获得可靠比较蛋白质组学结论的基石，推动该领域向着更严谨、更可靠的方向发展。相关数据已公开共享，便于同行验证和进一步探索。