甲基硫代烷烃还原酶（MAR）的结构与调控机制解析：细菌获取挥发性有机硫化合物的新途径

《Nature Catalysis》：Architecture, catalysis and regulation of methylthio-alkane reductase for bacterial sulfur acquisition from volatile organic compounds

本刊推荐：研究人员针对细菌如何从挥发性有机硫化合物（VOSCs）中获取硫元素这一科学问题，开展了甲基硫代烷烃还原酶（MAR）系统的结构与功能研究。通过冷冻电镜技术解析了MAR的原子分辨率结构，发现其结构与固氮酶高度相似，含有mar1和mar2两种金属辅因子，并首次揭示了MarS蛋白通过调控MarDK复合物活性来实现硫酸盐响应性调节的分子机制。这项研究拓展了固氮酶超家族的功能认知，为微生物硫代谢提供了新的理论框架。

　　

在微生物的世界里，硫元素是生命活动不可或缺的基本元素之一，但细菌如何从环境中高效获取硫的奥秘一直未被完全揭示。近年来，科学家发现某些厌氧光合细菌能够利用一类特殊的酶系统——甲基硫代烷烃还原酶（MAR），从挥atile有机硫化合物（VOSCs）中获取硫元素。这一过程通过还原性裂解C-S键实现，例如将甲基硫代乙醇（MT-EtOH）和二甲基硫醚（DMS）分别转化为乙烯和甲烷，同时释放出可供甲硫氨酸合成的甲硫醇。更引人注目的是，MAR系统所依赖的marBHDK基因与固氮酶基因存在高度相似性，暗示着自然界的酶系统可能存在着远超我们认知的功能多样性。

为了深入解析MAR系统的分子机制，由Srividya Murali和Guo-Bin Hu共同领导的研究团队在《Nature Catalysis》上发表了最新研究成果。他们首次成功从深红螺菌（Rhodospirillum rubrum）中天然纯化出MAR酶系统，并通过冷冻电镜技术解析了其原子分辨率结构，揭示了这一系统与固氮酶惊人的结构相似性及其独特的调控机制。

研究团队采用的主要技术方法包括：通过同源表达系统在深红螺菌中高效表达带有组氨酸标签的MAR组分；利用镍亲和层析和阴离子交换色谱进行酶蛋白纯化；运用冷冻电镜（cryo-EM）解析MarDK蛋白的三维结构；通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析金属含量；借助电子顺磁共振（EPR）光谱研究金属辅因子的电子特性；并采用遗传学手段验证蛋白功能。

MAR是双组分系统用于VOSCs的硫获取

研究发现MAR是一个由MarH和MarDK组成的双组分系统，其催化活性严格依赖ATP和电子供体，需要在无氧条件下进行。通过构建含有组氨酸标签的同源表达系统，研究人员将MAR的纯化效率提高了300倍以上，使其达到99%的纯度。分析性尺寸排阻色谱显示，活性MAR系统由62 kDa的MarH二聚体和228 kDa的MarDK四聚体组成，同时还发现了一个由MarS蛋白（原名A3441）与MarDK结合形成的高分子量复合物，这一发现为理解MAR的活性调控提供了重要线索。

MAR结构与固氮酶折叠平行

冷冻电镜结构分析表明，MarDK采用α2β2构型并具有C2对称性，这与所有已知的固氮酶、DPOR和COR系统相似。MarD和MarK亚基均采用固氮酶特征的三结构域折叠模式，每个结构域由四个β片层（结构域I和II）或五个β片层（结构域III）组成，通过五个α螺旋将其拉近。尽管固氮酶折叠在N2ase、DPOR、COR和MAR系统中是保守的，但在最终的结构架构上存在关键差异。

MAR金属辅因子类似N2ase P和M簇

结构分析显示，MarDK含有两个复杂的金属辅因子：mar1簇和mar2簇。mar1簇是一个P簇类似物，由六个半胱氨酸残基配位，但在氧化状态下缺失一个中心铁原子（Fe#8），这种构型与先前表征的NifK Ser188Ala突变体最为相似。mar2簇则推测是一个类似于铁铁辅因子（FeFe-co）的活性中心，由MarD Cys270和MarD His429配位，这一结论得到了点突变实验的验证。

金属含量分析显示，每个MarDK四聚体含有约32个铁原子，与固氮酶中铁含量相当，但钒和钼含量可忽略不计。EPR光谱在ATP存在条件下检测到了与铁固氮酶E1(H)和E1(H)*中间体相似的特征信号，为mar2簇与FeFe-co的相似性提供了光谱学证据。此外，MAR对CO的抑制响应曲线与钒固氮酶相似，都表现出先增强后抑制的双相行为，进一步支持了其活性位点与固氮酶的相似性。

MAR成熟利用MarB或N2ase NifB

研究发现，MAR基因簇中高度保守的marB基因编码一个与NifB高度相似（48%序列相似性）的蛋白。遗传学实验证明，MarB和NifB均能成熟化MarDK，但两者产生的酶活性谱存在差异：当使用NifB时，DMS裂解为甲烷的活性降低，而MT-EtOH裂解为乙烯的活性增加。这一发现表明，MarB和NifB可能合成略有不同的辅因子，或者将相同辅因子以不同方向放置，从而影响底物结合和催化过程。

MarS在硫酸盐流入或黑暗时抑制MAR活性

MarS被鉴定为一个PadR家族翼螺旋蛋白，其功能与固氮酶的G亚基、CowN蛋白或Shethna蛋白II不同。体内实验表明，MarS并不提供氧或CO保护，而是在硫酸盐流入或黑暗条件下（当光磷酸化无法有效产生ATP时）关闭MAR活性。纯化的MAR在缺失MarS的情况下活性提高了2倍，这与MarS通过结合MarDK形成多聚体复合物来阻断MarH与MarDK相互作用的模型一致。

AlphaFold3模型预测，四个MarS单体形成两个二聚体，桥接两个相邻的MarDK四聚体。MarS的螺旋3预计插入到MarD螺旋5和MarK螺旋6附近，与MarH螺旋4的插入方式相似但不同。这种调控机制与固氮酶通过DRAG和DRAT进行的调控有本质区别，表明自然界演化出了不同的策略来调节氮酶超家族成员的活性。

这项研究的重要意义在于首次揭示了固氮酶超家族在硫代谢中的功能扩展。MAR系统的发现表明，固氮酶样酶系统不仅参与氮固定（N2ase）和碳/能量代谢（DPOR、COR和CfbCD），还负责硫代谢，这大大拓展了我们对这一重要酶超家族功能多样性的认知。特别是MAR能够从MT-EtOH产生乙烯，这为微生物生产这一平台化学品提供了有前景的替代途径，有助于减少对化石燃料的依赖。

更为重要的是，研究揭示了MarB和NifB均能成熟化推测的MarDK mar2簇，且这一活性需要保守的MarD残基Cys270和新型His429，强烈表明类似于固氮酶[8Fe-9S-C] L簇（NifB-co）的结构是未知功能NFL系统催化金属辅因子的核心。观测到的EPR信号相似性为mar2簇类似于FeFe-co提供了首个光谱证据，表明催化辅因子可能以氢化物形式积累还原当量，并通过硫释放激活后再与底物反应。

总之，这项研究不仅解决了一个具体的科学问题——细菌如何利用固氮酶样系统从VOSCs中获取硫元素，更重要的是，它揭示了固氮酶样酶家族在微生物代谢中的反应性、机制和调控范围比先前认为的更广泛。这些发现为理解微生物如何适应不同环境条件、优化元素利用策略提供了新的视角，也为开发基于微生物的硫代谢工程技术奠定了理论基础。随着对更多未知功能的NFL系统进行表征，我们可能会发现自然界利用固氮酶折叠来解决各种生化挑战的更多惊人例子。