甲基硫代烷烃还原酶利用固氮酶金属簇实现碳硫键裂解的新机制

《Nature Catalysis》：Methylthio-alkane reductases use nitrogenase metalloclusters for carbon–sulfur bond cleavage

本研究针对甲基硫代烷烃还原酶（Mar）催化机制不明的科学问题，通过解析其2.75?冷冻电镜结构，首次发现该酶含有固氮酶特有的P-簇（[Fe8S7]）和[Fe8S9C]簇，但缺乏(R)-高柠檬酸配体。研究阐明Mar通过独特的底物通道实现对挥发性有机硫化合物（VOSCs）的专一性还原，为生物技术制备乙烯（C2H4）和甲烷（CH4）提供了新策略。

　　

在微生物代谢领域，甲基硫代烷烃还原酶（methylthio-alkane reductase, Mar）一直是个引人入胜的谜题。这类酶能够将甲基化的硫化合物转化为甲硫醇（methanethiol）和小分子烃类，如乙烯（C₂H₄）、乙烷（C₂H₆）和甲烷（CH₄），这一过程不仅对全球硫循环至关重要，还具有重要的生物技术应用前景。特别是在可再生能源领域，Mar酶系能够生物合成乙烯——这种目前完全依赖化石燃料生产的重要化工原料。然而，令人困惑的是，尽管Mar被归类为固氮酶样（nitrogenase-like, Nfl）酶，它们却无法像经典固氮酶那样将氮气（N₂）还原为氨（NH₃）。这种功能差异背后的结构基础一直是领域内未解的关键科学问题。

为了解决这一难题，由Ana Lago-Maciel和Johannes G. Rebelein领导的研究团队在《Nature Catalysis》上发表了突破性研究成果。他们发现Mar酶竟然含有迄今为止仅在固氮酶中发现的大型金属簇，这一发现不仅重新定义了我们对固氮酶超家族催化机制的理解，还为可持续生物制造提供了新的可能性。

研究人员采用多学科技术手段展开系统性研究。关键实验技术包括：在工程化Rhodobacter capsulatus菌株中异源表达Mar酶复合体；通过亲和色谱分别纯化还原酶组分（MarH₂）和催化组分（Mar(DK)₂）；利用质量光度法确定酶复合体的化学计量比；采用厌氧单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析Mar酶复合体的分子结构；通过电感耦合等离子体光学发射光谱（ICP-OES）分析金属含量；借助高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）检测(R)-高柠檬酸；利用电子顺磁共振（EPR）光谱研究金属簇的氧化还原状态；通过核磁共振（NMR）评估氮气还原活性；运用CAVER软件预测底物通道。

结构表征揭示独特组装机制

研究团队通过巧妙的实验设计，成功解析了Mar(DK)₂H₂复合体的2.75?分辨率结构。质量光度法分析显示，还原酶组分形成69kDa的MarH₂同源二聚体，而催化组分形成227kDa的Mar(DK)₂异源四聚体，这种化学计量与钼固氮酶（Mo-nitrogenase）完全一致。酶活性实验证实，Mar能够以ATP依赖的方式还原多种底物，包括(2-甲硫基)乙醇（MT-EtOH）、乙基甲基硫醚（EMS）和二甲基硫醚（DMS），分别产生C₂H₄、C₂H₆和CH₄，同时不产生分子氢（H₂）。

氮酶辅因子在Mar中的意外发现

最令人惊讶的发现来自对Mar活性位点的结构分析。研究人员观察到Mar催化组分中含有两个重要的金属簇：P-簇（[Fe₈S₇]-簇）和[Fe₈S₉C]-簇，后者是铁钼辅因子（FeMoco）的前体。ICP-OES分析证实每个Mar(DK)₂异源四聚体含有32.6±5.3个铁原子，与两个P-簇和两个[Fe₈S₉C]-簇的存在一致，且未检测到钼或钒。HPLC-MS分析进一步显示Mar中缺乏(R)-高柠檬酸，这与经典固氮酶形成鲜明对比。

金属簇配位环境的独特性

[Fe₈S₉C]-簇在Mar中的配位方式与固氮酶存在显著差异。该簇仅通过Cys270^MarD和His429^MarD两个残基与蛋白结合，而Mo-固氮酶中的FeMoco则通过Cys275^AvNifD和His442^AvNifD配位，并包含(R)-高柠檬酸配体。这种差异导致[Fe₈S₉C]-簇在Mar中采取四面体配位几何，而非固氮酶中的八面体配位。特别值得注意的是，His429^MarD位于MarD特有的延伸环（Loop I）上，这一结构特征解释了为何之前的序列分析未能预测到该配位残基。

底物通道决定催化特异性

CAVER分析揭示了Mar与固氮酶在底物通道方面的关键差异。Mo-固氮酶的底物通道受到Tyr229^AvNifD和Ser278^AvNifD的氢键门控限制，而Mar的两个主要底物通道（通道I和II）则没有这种空间阻碍。通道I起源于MarD和MarK的界面，经过带硫S5A通向S2B，并占据因缺乏(R)-高柠檬酸而留下的空腔。这种开放的通道结构使得较大的挥发性有机硫化合物（VOSCs）能够顺利接近活性位点，而固氮酶由于通道限制无法利用这些底物。

光谱学证据支持金属簇特性

EPR光谱分析为金属簇的特性提供了重要佐证。DT还原的MarH₂显示出典型的[Fe₄S₄]¹⁺簇的S=1/2和S=3/2物种信号。Mar(DK)₂在-390mV（相对于标准氢电极）时出现相对尖锐的S=1/2信号（g_平均=1.96），而在氧化条件下（E=-250mV）出现特殊的宽S=1/2信号（g_平均=1.91），这与含[Fe₈S₉C]-簇的固氮酶成熟酶Nif(EN)₂的信号非常相似。这些光谱特征为[Fe₈S₉C]-簇在Mar中的存在提供了有力证据。

固氮酶金属簇的进化新见解

系统发育分析表明，甲基硫代烷烃还原酶和固氮酶的最后共同祖先可能已经含有P-簇和大型活性位点簇。祖先序列重建 confidently 推断出六个半胱氨酸残基（后验概率为1），这些残基在Mar和固氮酶中同源位置配位P-簇。对于[Fe₈S₉C]-簇的配位残基，研究 confidently 推断出与Cys270^MarD同源的半胱氨酸（后验概率0.99），但由于组氨酸配体位于不同的环上，未能推断出与His429^MarD或His442^AvNifD等效的残基。这些发现表明，复杂的金属簇在生物固氮起源之前就已经存在。

本研究从根本上改变了我们对固氮酶超家族催化机制的理解。研究发现甲基硫代烷烃还原酶含有固氮酶特有的大型金属簇，但却无法进行氮气固定，这表明蛋白质支架而非金属簇本身决定了酶的催化特异性。Mar中保守氮酶残基（Val70^AvNifD、Gln191^AvNifD和His195^AvNifD）的缺失以及(R)-高柠檬酸的缺乏可能是其无法还原氮气的原因。更重要的是，Mar中更宽的底物通道使其能够专一性识别和还原甲基化硫化合物。

这项研究的意义远超出了基础科学领域。它揭示了[Fe₈S₉C]-簇在氨形成之外的催化潜力，为工程化改造甲基硫代烷烃还原酶用于生物技术生产小分子烃类（如甲烷和乙烯）打开了大门。在气候变化日益严峻的背景下，这种能够将有机硫废物转化为有价值化学品的酶系统，为可持续化学生产提供了有前景的替代方案。同时，该研究也为理解固氮酶超家族的进化历史提供了重要线索，表明复杂的金属簇系统在自然界中的出现早于生物固氮能力的演化。