在磷二酰胺吗啉寡聚物合成过程中，使用硫醇控制对醌甲醚烷基化杂质的生成

《Organic Process Research & Development》：Controlling para-Quinone Methide Alkylation Impurities with Thiols during Phosphorodiamidate Morpholino Oligomer Synthesis

双保护形态莫林鸟苷（DPG）在脱保护过程中生成活性对位醌亚甲基（p-QM），导致PMO烷基化杂质M+106的形成。通过筛选多种硫醇，发现1,4-二硫代二乙醇（DTT）在1.0 M浓度时能有效捕获p-QM，抑制M+106生成，并成功应用于商业化PMO生产。

　　在当今的生物制药领域，寡核苷酸药物的开发与生产正日益受到重视。其中，磷酸二酯形态啉寡核苷酸（Phosphorodiamidate morpholino oligomers, PMOs）因其在基因治疗中的潜力，尤其是在杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）的治疗中，成为研究热点。PMOs 是一种特殊的核酸模拟物，其核心结构替代了传统 RNA 中的核糖环和带负电的磷酸二酯骨架，取而代之的是形态啉环和中性磷酸二酯基团。这种结构的改变不仅提高了其在体内稳定性，还增强了其与目标基因序列的特异性结合能力，从而为疾病治疗提供了新的思路。

然而，在 PMO 的合成过程中，特别是在去保护步骤中，会产生一些副产物，其中一种名为对醌甲烷（para-quinone methide, p-QM）的反应性物质尤为值得关注。p-QM 是一种 Michael 受体，容易与亲核试剂发生反应，从而导致分子量增加的副产物，例如 M+106。这种副产物的存在会影响最终药物产品的纯度和质量，因此需要采取有效措施进行控制。本文的研究旨在探讨使用硫醇作为 p-QM 的捕获剂，以优化 PMO 合成过程中的杂质控制，并确定最佳的硫醇浓度。

在 PMO 的合成过程中，使用双保护的形态啉鸟苷（doubly protected morpholino guanosine, DPG）作为基本单元，其在去保护时会生成 p-QM。为了减少 p-QM 与亲核试剂（如形态啉胸苷）的反应，研究者尝试使用不同的硫醇进行实验。硫醇因其较高的反应活性，被认为是有效的捕获剂。在实验中，选择了一些常见的硫醇，如苯甲硫醇、二硫苏糖醇（DTT）、2-巯基乙醇、硫代甘醇酸钠、硫代甘醇酸和半胱氨酸，以评估它们对 M+106 副产物的抑制效果。结果表明，DTT 在抑制 M+106 方面表现出了良好的效果，尤其是在 1.0 M 浓度下，能够有效减少该杂质的形成。

为了进一步验证 DTT 的有效性，研究者进行了多批次实验，以评估其在不同浓度下的影响。在实验中，选择了富含 G 的 25-mer OOR（oligonucleotide on resin），通过调整 DTT 的浓度，观察其对 M+106 副产物的抑制效果。实验结果显示，随着 DTT 浓度的增加，M+106 的相对强度逐渐降低，且在 1.0 M 浓度时，该杂质的形成被有效抑制。此外，实验还发现，当 DTT 浓度超过 1.0 M 时，M+106 的含量不再显著变化，表明 1.0 M 是一个足够有效的浓度。

在实际生产中，DTT 的使用不仅提高了杂质控制的效果，还对整体生产流程带来了操作上的便利。例如，DTT 是水溶性的，且气味较轻，避免了其他硫醇可能带来的操作难题。此外，DTT 不含有 pH 调节基团，使得其在去保护过程中不会干扰其他化学反应。因此，DTT 成为了 PMO 合成过程中控制 p-QM 副产物的理想选择。

在实验过程中，研究者采用了多种分析手段，如 MALDI-TOF 质谱和 IP-RP 高效液相色谱（HPLC），以评估不同 DTT 浓度对 M+106 副产物的影响。MALDI-TOF 质谱分析结果显示，M+106 的相对强度随着 DTT 浓度的增加而显著下降，而在 1.0 M 浓度时，其含量已经接近可接受的水平。IP-RP HPLC 分析同样表明，随着 DTT 浓度的增加，PMO 的纯度也随之提高，这进一步验证了 DTT 在控制 M+106 副产物方面的有效性。

此外，研究者还通过实验确定了 DTT 在不同浓度下的最佳使用范围。实验发现，当 DTT 浓度低于 1.0 M 时，虽然 M+106 的形成有所减少，但并未完全抑制，且可能产生多重 4-羟基苯甲基基团的副产物。而当 DTT 浓度达到 1.0 M 时，M+106 的含量显著下降，且不再随浓度的增加而变化。因此，研究者认为 1.0 M 是 DTT 在控制 M+106 副产物时的最优浓度。

在实际生产中，这一结论被成功应用于 PMO-3 的大规模生产。研究者将 DTT 浓度设定为 1.0 M，并将其加入到去保护反应混合物中。结果表明，这一调整不仅有效减少了 M+106 的形成，还提高了整体的生产效率和成本效益。因此，DTT 成为了 PMO 合成过程中控制 p-QM 副产物的重要工具。

综上所述，通过引入 DTT 作为硫醇捕获剂，研究者成功控制了 PMO 合成过程中产生的 M+106 副产物。这一发现不仅为 PMO 的质量控制提供了新的方法，还为相关药物的生产带来了实际应用价值。随着对 PMO 合成过程的进一步优化，以及对相关副产物的深入研究，相信未来在寡核苷酸药物的开发与生产中，将会有更多类似的技术被应用，以提高药物的质量和纯度，从而更好地满足临床需求。