含有铁茂的德穆拉米肽（Desmuramylpeptides）具有灵活的构象，并表现出NOD2激动活性

《Organometallics》：Ferrocene-Containing Desmuramylpeptides Adopt A Flexible Conformation and Exhibit NOD2 Agonistic Activity

分子化学与免疫学交叉研究：新型铁氧烷修饰脱苏霉酰肽的NOD2受体激动活性与构效关系分析。

　　近年来，随着对分子化学和材料科学的深入研究，二茂铁（ferrocene）因其出色的稳定性、芳香电荷性、可逆且温和的氧化还原行为、有机溶剂中的溶解性、空气稳定性以及脂溶性，受到了广泛关注。二茂铁在药物化学领域也逐渐展现出其潜力，尤其在20世纪90年代后期，二茂铁作为生物等效基团的替代物在药物分子中的应用得到了显著提升。在这一背景下，研究者们开始探索二茂铁在免疫调节方面的潜力，特别是在NOD2（核苷酸结合寡聚化域含蛋白2）受体的激活中。NOD2是NOD样受体家族中用于病原体识别的关键成员，其激活可引发免疫信号，从而激活NF-κB和MAPK通路，并促进多种免疫效应因子的产生，包括细胞因子。

在本研究中，我们合成了一系列新的二茂铁修饰的脱-N-乙酰基肽（desmuramylpeptides），以探索其作为NOD2激动剂的潜力。这些二茂铁修饰的肽包括以l- Ala–D-isoGln（一种二肽）和Gly–l-Val–D-Glu（一种三肽）为核心结构，并通过不同的二茂铁连接方式进行修饰。通过详细的光谱分析，我们发现这些肽具有相对灵活的结构，这种灵活性是由较弱的分子内氢键引起的。进一步的生物学评估显示，其中一些化合物在HEK-Blue NOD2报告细胞中表现出显著的NOD2激动活性，特别是在12b和12c两种化合物中，其EC50值分别为44.1和252.6 nM，表明其在NOD2激动剂活性方面具有较高的效力。

研究的动机源于二茂铁修饰的芳香肽在NOD2激活中的显著效果，以及二茂铁作为生物等效基团的潜力。因此，我们设计并合成了二茂铁修饰的l- Ala–D-isoGln和Gly–l-Val–D-Glu的衍生物，并评估了它们的免疫调节活性。通过红外光谱（IR）分析，我们观察到这些肽的氢键模式在不同浓度和温度下有所变化，表明它们的结构灵活性。对于12a、12c和12f，其自由（free）和结合（associated）NH基团的比例在稀释过程中有所增加，这可能意味着这些肽形成了部分的分子间氢键。而12b、12d和12e则在相同条件下维持了分子内氢键的稳定，这表明其结构更加紧密。

此外，我们还研究了温度对氢键模式的影响。对于12b，其NH基团的红外信号在不同温度下保持稳定，表明其分子内氢键具有较高的热稳定性。而12a和12c–f的NH基团信号则随温度升高而发生变化，这表明它们的氢键模式较为动态，可能由较弱的氢键作用引起。通过核磁共振（NMR）分析，我们进一步确认了这些肽的结构特性。NMR信号的化学位移变化表明，NH基团在不同溶剂和温度下的响应，从而揭示了其结构的灵活性。例如，在12e中，NH基团的化学位移较大，这表明其可能参与了较弱的氢键作用，而在12c中，NH基团的化学位移较小，表明其参与了较强的氢键作用。

在生物学评估中，我们使用了HEK-Blue NOD2细胞系，这是一种经过验证的商业报告细胞，能够准确反映NOD2激动剂的活性。在这些细胞中，我们测试了不同浓度的二茂铁修饰肽，发现其中12b和12c具有最强的NOD2激动活性，且其EC50值较低，表明其具有较高的效力。我们还使用了人外周血单核细胞（PBMCs）进行进一步的免疫学评估，这些细胞是研究NOD2激动剂活性的理想生理相关模型，因为它们包含了多种NOD2相关蛋白和下游信号蛋白。通过使用LEGENDplex Human Essential Immune Response Panel，我们测量了这些细胞在激活NOD2后释放的细胞因子和趋化因子的水平，并观察到12b在某些情况下能够诱导更高的细胞因子分泌，特别是在与脂多糖（LPS）共刺激的情况下。

本研究的结论是，我们成功设计并合成了具有NOD2激动活性的新型二茂铁修饰脱-N-乙酰基肽。这些肽在结构上表现出较高的灵活性，而其中12b具有最强的NOD2激动活性，且其EC50值较低，表明其在药物开发中的潜力。此外，我们发现12b在PBMCs中能够诱导明显的促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，特别是在与LPS共刺激的情况下。这些结果表明，12b在生理相关的免疫环境中具有重要的功能意义，并且其与TLR4通路之间存在协同作用。

在实验部分，我们详细描述了二茂铁前体（如1、B和4）的合成过程，并通过已发表的实验方法进行了制备。这些前体随后用于合成目标肽，包括10c/g、11a–c、12a–f和13d/f。在这些肽的合成过程中，我们采用了标准的EDC/HOBt偶联方法，这使得反应效率较高。在合成过程中，我们还研究了不同条件对反应的影响，例如使用不同的溶剂和温度，并通过薄层色谱（TLC）和柱色谱（column chromatography）对产物进行了纯化。最终，我们获得了目标肽的高纯度产物，并通过红外光谱和核磁共振对它们的结构进行了分析。

在实验方法中，我们还详细描述了如何通过不同溶剂和温度来评估这些肽的结构和活性。例如，我们使用了CDCl3作为非极性溶剂，以避免溶剂对氢键模式的干扰。通过红外光谱，我们能够观察到这些肽的氢键模式，并通过核磁共振进一步确认了它们的结构特性。此外，我们还研究了不同溶剂对这些肽的稳定性的影响，并发现它们在DMSO中表现出较高的稳定性，这表明它们在生物评估中的适用性。

综上所述，本研究展示了二茂铁修饰的脱-N-乙酰基肽在NOD2激动中的潜力，并提供了设计和优化二茂铁基NOD2免疫调节剂的框架。这些结果不仅有助于理解二茂铁在药物分子中的作用，还为开发新的免疫调节剂或疫苗佐剂提供了重要的基础。