谷氨酰胺酶抑制剂CB-839诱导结直肠癌细胞代谢重编程的机制研究

《Scientific Reports》：Glutaminase inhibitor CB-839 causes metabolic adjustments in colorectal cancer cells

本研究针对结直肠癌(CRC)细胞对谷氨酰胺的代谢依赖性问题，通过评估GLS-1抑制剂CB-839对不同CRC细胞系的抗肿瘤活性及代谢调控机制，发现CB-839可通过抑制谷氨酰胺分解途径，诱导细胞周期阻滞和能量代谢重编程（糖酵解增强），并显著影响三羧酸循环、氨基酸代谢和氧化还原平衡。该研究为阐明CB-839的响应与耐药机制提供了重要理论依据，对推进靶向谷氨酰胺代谢的结直肠癌治疗策略具有积极意义。

　　

在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是第二大癌症致死原因和第三大常见恶性肿瘤。尽管筛查项目的推广和早期诊断使总体死亡率有所下降，但年轻患者（50岁以下）的发病率却呈现上升趋势，这一现象引起了医学界的广泛关注。癌细胞为了适应快速生长和增殖的需要，会重新编程自身的代谢途径。与正常细胞不同，肿瘤细胞优先利用不同的能源来满足其高能量和生物合成的需求。其中，谷氨酰胺（Glutamine）被发现在支持癌症生长和增殖中扮演着关键角色，许多肿瘤类型（包括结直肠癌细胞）对这种氨基酸产生了“成瘾”性。

谷氨酰胺不仅是碳源和氮源，为氨基酸、核苷酸和脂质生物合成所必需，其脱氨产物谷氨酸（Glutamate）还可转化为α-酮戊二酸（α-ketoglutarate），从而通过补充三羧酸（Tricarboxylic Acid Cycle, TCA cycle，又称Krebs循环）来支持能量生产。此外，谷氨酰胺衍生的谷氨酸也是谷胱甘肽（Glutathione, GSH）的组成部分，参与维持细胞氧化还原稳态。线粒体酶谷氨酰胺酶（Glutaminase, GLS）负责将谷氨酰胺转化为谷氨酸，这是谷氨酰胺代谢的第一个也是限速步骤。GLS-1（肾脏型）的过度表达与包括结直肠癌在内的多种癌症预后不良和总体生存率低相关。因此，靶向谷氨酰胺代谢成为癌症治疗中一个吸引人且前景广阔的策略。

在众多靶向谷氨酰胺代谢的药物中，Telaglenastat（CB-839）作为一种强效、选择性、可逆且具有口服生物利用度的GLS-1抑制剂，已在多种实体瘤和血液恶性肿瘤的临床试验中显示出潜力，但其在结直肠癌细胞中的抗肿瘤效果评估尚不充分。因此，深入研究CB-839对结直肠癌细胞的影响，对于改进针对CRC患者的靶向治疗和开发创新联合疗法至关重要。

本研究旨在评估CB-839处理对不同结直肠癌细胞系存活和增殖的影响，并探究由此引发的代谢适应，特别是在能量通路方面的变化。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：通过MTT法评估细胞活力；利用流式细胞术分析细胞周期分布；采用Seahorse XF分析仪实时检测ATP产生速率；结合非靶向气相色谱-质谱联用（GC-MS）和核磁共振氢谱（1H-NMR）进行代谢组学分析，以探索全局代谢谱；并针对三羧酸循环中间体进行了靶向GC-MS/MS分析。所有实验均使用人结直肠癌细胞系（HCT116, HT29, SW480）进行，细胞在标准条件下培养，并暴露于不同浓度的CB-839（通常为48小时，部分实验达96小时）。

CB-839对CRC细胞产生细胞毒性作用

为了探究CB-839是否对CRC细胞产生细胞毒性作用，研究人员使用MTT法评估了细胞活力。结果显示，CB-839处理以剂量依赖的方式降低了HT29细胞系的活力。此外，CB-839对HT29细胞的细胞毒性作用在处理96小时后（CC₅₀ = 8.75 μM）比处理48小时后（CC₅₀ = 19.10 μM）更强。SW480细胞最不敏感，需要更高的药物浓度才能达到50%的活力抑制。令人惊讶的是，其CC₅₀在处理96小时后（CC₅₀ = 51.41 μM）高于处理48小时后（CC₅₀ = 37.48 μM）。最后，HCT116细胞对药物表现出中等敏感性（48小时CC₅₀ = 43.26 μM，96小时CC₅₀ = 26.31 μM）。这些结果促使研究人员选择最敏感和最不敏感的细胞系HT29和SW480进行后续实验。

CB-839改变HT29细胞的细胞周期进程

基于细胞活力的结果，研究人员推测CB-839会降低增殖能力。处理48小时后，通过流式细胞术检测了HT29和SW480细胞系在细胞周期不同阶段的分布。HT29细胞在处理后以剂量依赖的方式累积在S期，同时观察到处于有丝分裂期（G2/M）的细胞百分比减少。此外，在HT29细胞中观察到亚G0期细胞增加。而在SW480细胞中，处理后未观察到细胞周期进程的显著改变。

CB-839处理导致CRC细胞代谢重编程

考虑到谷氨酰胺在能量和生物合成过程中的关键作用，研究人员通过非靶向GC-MS和1H-NMR分析探索了代谢谱。主成分分析（PCA）显示，在HT29和SW480细胞系中，对照组和处理组之间均存在良好分离，表明GLS-1抑制对CRC细胞代谢产生了强烈影响。此外，得分图中不同细胞组的空间分布反映了药物浓度的升高，提示存在剂量依赖的代谢反应。

随后的单变量统计分析揭示了CB-839处理后两种CRC细胞中广泛的代谢重编程。如图4所示，与预期一致，处理细胞中谷氨酰胺浓度增加，而谷氨酸丰度在GLS-1抑制后下降。在HT29细胞中，观察到处理细胞中糖含量（葡萄糖、果糖、半乳糖）减少，而SW480细胞中仅葡萄糖含量降低。此外，细胞内乳酸水平随处理增加。代谢分析结果提示CB-839导致ATP形式的能量底物含量减少。氨基酸池在GLS-1抑制后发生深刻改变，特别是丙氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和酪氨酸在两种细胞系中均显著减少。单磷酸核苷酸、肌苷和尿苷单磷酸（IMP和UMP）在处理后显著降低。在脂肪酸代谢方面，发现两种处理细胞系中肉碱和几种短链脂肪酸（2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、3-甲基-2-氧代戊酸）显著减少。药物处理改变了参与氧化还原稳态的物质，特别是谷胱甘肽含量在两种细胞系中均受影响，而NAD⁺和NADP⁺主要在HT29细胞中减少。

CB-839诱导HT29细胞ATP产生从线粒体呼吸向糖酵解转变

CRC细胞系的代谢谱分析提示CB-839给药后能量生产通路受损。因此，研究人员通过Seahorse分析仪的XF实时ATP速率测定法评估了HT29和SW480细胞在用15 μM CB-839处理48小时后的能量表型及其变化。在HT29细胞中，观察到线粒体ATP产生速率显著降低，而糖酵解ATP速率增加。HT29细胞糖酵解活性的增加也通过细胞乳酸释放增加导致的细胞外酸化率显著升高得到证实。相比之下，SW480细胞未观察到显著变化，总ATP产生速率和乳酸释放几乎保持恒定。

CB-839损害HT29和SW480细胞中的Krebs循环

考虑到CB-839处理后的代谢重编程趋向糖酵解通路，以及谷氨酰胺作为三羧酸循环回补底物的作用，研究人员通过靶向方法分析了Krebs循环中间体。尽管SW480细胞对CB-839的增殖抑制活性具有抵抗力，但靶向分析显示两种测试细胞系均存在显著改变。具体而言，在HT29细胞中，观察到谷氨酰胺分解下游的TCA中间体（尤其是α-酮戊二酸、琥珀酸和富马酸）水平显著降低。在最高剂量CB-839下，观察到草酰乙酸和苹果酸水平较低，而不同药物浓度下的柠檬酸丰度未发现变化。另一方面，在SW480细胞中观察到所有Krebs循环中间体含量的改变，包括柠檬酸，这与HT29细胞不同。

本研究探讨了GLS-1抑制剂CB-839以及由此导致的谷氨酰胺代谢受损对结直肠癌细胞的影响。特别比较了两种谷氨酰胺依赖的细胞系。尽管都依赖谷氨酰胺，但CRC细胞对CB-839处理表现出不同的反应。特别是，谷氨酰胺代谢受损主要影响增殖能力、能量代谢和ATP生产通路、氨基酸谱以及氧化还原平衡。虽然SW480细胞对药物的敏感性较低，但它们在代谢水平上表现出与HT29细胞相似的深刻改变。这些改变可能代表细胞试图适应和响应CB-839药物。另一方面，在SW480细胞中观察到的柠檬酸水平下降可能代表了一种对抗GLS-1药理抑制的机制，并至少部分解释了其对药物敏感性较低的原因。此外，本研究揭示了两细胞系对药物反应的一个重要差异，即仅在HT29细胞中发现NAD⁺和NADP⁺的减少。考虑到这两种辅因子在肿瘤生长和增殖中的基本作用，可以推测它们与CB-839治疗的不同结果有关。

这项研究为了解CB-839在结直肠癌中的疗效以及CRC细胞可能的耐药机制提供了一个起点。所进行的实验揭示了HT29细胞活力和增殖能力的降低，以及响应和耐药细胞在处理后的代谢改变。然而，需要进一步的研究来完全阐明导致这些变化的潜在机制，以及这些改变是否与所研究的CRC细胞对药物的不同反应有关。尽管存在这些局限性，该研究为理解导致药物敏感性或耐药性的生化特征和机制提供了有价值的见解，并为有前景的联合疗法提供了强有力的理论依据。