利用嗜热底盘实现的高通量筛选方法，用于筛选一种耐热的荧光报告基因

《ACS Synthetic Biology》：Thermophilic Chassis-Enabled High-Throughput Selection of a Thermostable Fluorogenic Reporter

高温稳定蛋白的理性设计与高通量筛选。利用耐温菌Ptherm筛选了基于Rosetta和ProteinMPNN预测的近万突变体库，成功获得荧光增强且耐热性显著提升的FAST变体（tsFAST/hyFAST）。通过结构模拟发现其稳定性源于盐桥和氢键网络优化。该体系可扩展至其他融合蛋白的表达监测，其中hyFAST因体积小（为GFP一半）且无需氧气成熟，成为工程极端厌氧菌用于生物传感和转化的理想工具。

　　

耐热蛋白在高温和恶劣条件下具有更长的保质期和更好的性能，从而降低了各种工业和生物技术应用的成本。然而，由于对稳定性与功能之间关系的理解有限，蛋白质稳定化的方法主要还是基于试错。因此，构建一个预测能够提高稳定性的突变组合文库，并通过实验进行验证，是一种显著改进的方法。然而，缺乏高通量筛选方法来处理中等规模的文库，这成为该领域的一个主要瓶颈。在这里，我们使用嗜热菌Parageobacillus thermoglucosidasius（简称Ptherm）来快速筛选由合理设计的耐热突变组成的组合文库（约10³–10⁴个突变），这些突变作用于中温荧光报告基因Y-FAST。在培养皿中，通过高温培养并暴露于荧光剂后，我们使用Rosetta和ProteinMPNN技术分别获得了两个序列生成的Ptherm菌落，这些菌落在55°C和68°C时表现出明显的荧光。从荧光菌落中分离出的Y-FAST变体比原始Y-FAST更亮，并且具有更强的抗热和抗化学变性的能力。AlphaFold预测的结构和分子动力学模拟显示，这些变体中存在增强稳定性的盐桥和氢键网络。随后证明了中等耐热的tsFAST和超耐热的hsFAST变体能够在高温（如55°C和68°C）下作为蛋白质表达和折叠的报告基因。我们这种基于嗜热菌底盘的组合文库生成和高通量筛选方法原则上可以扩展到其他与这些报告基因融合的蛋白质。此外，hsFAST蛋白体积较小（仅为绿色荧光蛋白的一半），并且其成熟过程不需要氧气，这使其非常适合用于改造极端厌氧菌以实现生物传感和生物转化。