通过快速液相色谱-质谱（fast LC-MS）技术，优化电子诱导解离参数以实现对甘油酯和磷脂的分子注释

《Analyst》：Optimisation of electron-induced dissociation parameters for molecular annotation of glycerides and phospholipids in fast LC-MS

脂质结构解析的电子诱导解离优化与LipidOracle软件开发及其在肝血浆样本中的应用。

　　电子诱导裂解（EIEIO）方法在脂质结构解析中展现出比传统碰撞诱导裂解（CID）更强的能力。EIEIO通过低能电子轰击单电荷离子，引发一系列自由基裂解反应，不仅能够提供与CID相似的诊断碎片，还能进一步揭示脂肪酰链中碳-碳双键的位置信息，以及脂肪酰链的区域化学特征（如sn-位置）。然而，尽管EIEIO在分析潜力上具有显著优势，其在常规液相色谱-质谱（LC-MS）工作流程中的实际应用仍鲜有研究。本文旨在探索EIEIO是否能够在快速的LC-MS流程中实现有效的脂质结构解析，特别是在复杂样品中，以达到高通量分析的目的。

为了实现这一目标，研究团队对多种脂质标准品进行了实验，包括不同类别和浓度的甘油酯和磷脂，并系统评估了反应时间、累积时间和电子动能对裂解效果的影响。实验结果表明，较短的反应时间（如30毫秒）能够稳定地产生用于脂质分类和sn-位置区分的强诊断信号，即使在低至200皮克（pg）的浓度下也能实现有效的结构解析。此外，研究团队开发了LipidOracle这一软件工具，它能够测试所有可能的异构体，并在面对缺失数据、噪声和拥挤光谱时，依然能准确判断双键位置。通过这种方式，LipidOracle显著提高了EIEIO在脂质结构分析中的可靠性。

对于双键位置的判断，实验发现较长的累积时间（如200毫秒）对于确定碳-碳双键的位置，尤其是在多不饱和脂质中，具有更好的效果。这种累积时间的增加有助于提高信号强度，减少噪声干扰，从而更准确地识别双键的具体位置。然而，研究也指出，随着反应时间的延长，某些关键碎片的信号强度会下降，甚至出现信号衰减的现象。这可能与自由基的二次裂解有关，即在较长的反应时间内，原本的碎片可能进一步裂解，导致信号减弱。因此，在优化EIEIO参数时，需要在反应时间和累积时间之间找到一个平衡点，以确保获得足够的诊断信息，同时避免信号丢失。

实验还发现，电子动能对EIEIO裂解效率具有重要影响。在12电子伏特（eV）的动能下，能够获得最佳的sn-位置和双键位置的碎片信号强度。尽管某些脂质（如PE）在较低动能（如10 eV）下也能表现出较高的sn-位置识别能力，但总体而言，12 eV的动能被证明是更优的选择。此外，研究还指出，新推出的SCIEX ZenoTOF 8600系统相较于旧系统（如7600）具有更高的灵敏度，这使得在更短的累积时间下（如50毫秒）仍能实现较为准确的双键位置判断。然而，即便如此，EIEIO在解析多不饱和脂质时仍面临一定的挑战，尤其是在信号重叠和碎片复杂性方面。

为了验证EIEIO在复杂样品中的应用效果，研究团队对肝脏和血浆提取物进行了分析。实验结果显示，在200毫秒的累积时间下，能够对大部分脂质进行有效的结构注释，包括脂质类别、脂肪酰链的长度、饱和度、sn-位置以及双键的具体位置。这一结果表明，EIEIO不仅适用于标准品分析，也能够在实际样品中实现高通量的结构解析。研究还强调，尽管EIEIO在解析能力上具有优势，但在实际操作中仍需面对一些挑战，如碎片信号的重叠、噪声干扰以及可能的氢转移反应。这些因素可能导致部分脂质的结构解析不够准确，尤其是在多不饱和脂质中，错误发现率（FDR）难以降低至低于20%的水平。

基于上述发现，研究团队提出了一种分层的LC-EIEIO-MS工作流程，以适应不同层次的分析需求。在常规分析中，建议使用较短的累积时间（如35毫秒）快速获取脂质的基本结构信息，包括头基类型、脂肪酰链长度和sn-连接信息。对于更深入的结构解析，如双键位置的准确判断，则需要更长的累积时间（如200毫秒）。这种分层策略充分利用了EIEIO在结构解析方面的优势，同时兼顾了分析效率，为脂质组学研究提供了实用的指导方案。

此外，研究还指出，虽然EIEIO在解析能力上表现出色，但其在实际应用中仍存在一些局限性。例如，随着电子动能的增加，氢转移反应会变得更加显著，这可能导致碎片信号的偏移，从而影响双键位置的判断。因此，在进行EIEIO分析时，需要综合考虑电子动能、反应时间和累积时间的优化，以确保获得高质量的结构信息。同时，由于多不饱和脂质的碎片信号重叠严重，进一步提高解析准确性的方法可能需要更精确的碎片强度预测模型，以实现更严格的匹配标准。

总之，本文通过系统的实验设计和数据分析，揭示了EIEIO在脂质结构解析中的潜力，并提出了优化的参数设置和分析策略。这些成果不仅为脂质组学研究提供了新的工具和方法，也为未来的高通量脂质分析奠定了基础。随着质谱技术的不断进步，EIEIO有望在更广泛的生物样本中得到应用，从而推动对脂质生物学功能的深入理解。