将用于检测噻吩卡西林和氯霉素的适配体结合使用，以便同时检测这两种抗生素

《Chemical Communications》：Combining aptamers for thiamphenicol and chloramphenicol for detecting both antibiotics

本研究通过捕获式SELEX技术筛选出TAP-1 aptamer，其Kd值为6.4 μM，结合CAP aptamer构建传感器，成功区分并检测TAP和CAP，在湖水样本中实现8.5 μM检测限。

　　本研究聚焦于开发一种能够同时检测两种抗生素——硫胺霉素（TAP）和氯霉素（CAP）的新型DNA适配体传感器。这两种抗生素都属于氨基糖苷类抗生素，具有相似的化学结构和物理化学性质，因此在实际应用中，它们的检测往往存在交叉干扰。为了应对这一挑战，研究团队通过一种称为“捕获-SELEX”（capture-SELEX）的方法，成功筛选出一种针对TAP的适配体，命名为TAP-1，并结合之前筛选出的CAP适配体CAP-1，构建了一个能够区分TAP和CAP的传感器阵列。

氯霉素（CAP）作为一种广谱抗生素，自20世纪中期被广泛使用，但其长期临床应用受到了严重副作用和细菌耐药性的限制，因此自1980年代起在多数国家的临床使用被逐渐禁止。为了克服这些问题，许多CAP的衍生物被开发出来，其中硫胺霉素（TAP）因其较低的毒性而在动物治疗中被广泛使用。然而，由于TAP与CAP结构相似，且在使用过程中可能不完全遵循药物残留控制规定，因此在食品和环境中可能存在TAP的残留污染。这种污染不仅影响食品安全，还可能对公众健康构成潜在威胁。因此，建立一种能够同时、准确检测TAP和CAP的方法显得尤为重要，有助于满足国际食品安全标准，并实现对整个CAP类抗生素的有效监控。

传统的检测方法通常依赖于仪器分析技术，如液相色谱法和免疫分析技术。这些方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但操作复杂、成本较高，并且可能受到样品基质的影响。相比之下，基于适配体的检测方法近年来受到越来越多的关注。适配体是一种单链寡核苷酸，能够特异性地结合目标分子。与传统的抗体不同，适配体在小分子目标检测中提供了多种非竞争性的检测策略，使得其在环境和食品监测领域具有独特的优势。

在本研究中，研究团队采用“捕获-SELEX”技术筛选出针对TAP的适配体。该技术的核心在于将含有30个随机化核苷酸的DNA库固定在链霉亲和素包被的磁珠上，通过与短链生物素化互补链的杂交实现固定。随后，将磁珠与TAP孵育，通过洗脱、回收和PCR扩增的方式，逐步筛选出具有高亲和力的适配体序列。整个筛选过程在特定缓冲体系中进行，共进行了15轮选择，缓冲液成分包括50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、300 mM NaCl和10 mM MgCl?。每轮选择后，通过实时PCR（RT-PCR）监测TAP结合的DNA量，并观察到在第14轮时，Ct值显著下降，表明适配体序列正在被有效富集。最终，通过深度测序分析第15轮的DNA库，获得了23,455条读数，其中两个主要序列家族被识别出来，TAP-1和TAP-6分别占32.5%和2.4%。此外，前10个最丰富的序列中，TAP-4未能归入任何家族，但因其出现频率较高，也被纳入后续的结合研究。

为了评估这些适配体的结合特性，研究团队采用了ThT（硫代荧光素）荧光结合实验。ThT是一种水溶性的荧光染料，在未结合DNA时几乎不发光，但在结合单链DNA，尤其是G-四链体结构时，其荧光强度显著增强。当TAP与TAP-1适配体结合时，ThT的荧光强度下降超过60%，表明TAP与TAP-1具有较强的结合能力。通过ThT实验测得的结合常数（Kd）为38 ± 3 μM，而通过等温滴定热量计（ITC）测得的Kd值为6.4 μM，表明ThT实验可能在一定程度上抑制了适配体的结合。这一结果也说明了TAP-1适配体在结合TAP时具有较高的亲和力。此外，TAP-4和TAP-6适配体的Kd值分别为357 ± 173 μM和554 ± 40 μM，表明它们的结合能力较弱。因此，TAP-1适配体相较于其他两个适配体具有更优的结合特性。

为了进一步验证TAP-1适配体对CAP的结合能力，研究团队同样采用了ThT荧光实验。结果显示，TAP-1适配体与CAP结合时，荧光强度下降超过70%，表明其对CAP也具有较高的亲和力，结合常数为27 ± 3 μM。相比之下，TAP-4和TAP-6适配体与CAP的结合常数分别为373 ± 31 μM和475 ± 46 μM，与它们对TAP的结合能力相似。这表明TAP-1适配体可能在结合TAP和CAP时涉及不同的结合区域，而其他适配体则可能在相似的结合区域中与这两种抗生素发生作用。此外，研究团队推测，CAP-1适配体与CAP的结合可能涉及硝基基团，而TAP-1适配体与TAP的结合可能涉及磺酸基团，这种差异导致了两者的结合选择性不同。

为了进一步探讨TAP-1适配体的结合机制，研究团队采用了圆二色光谱（CD）技术监测其结构变化。结果显示，TAP-1适配体在未结合TAP时呈现出典型的B型DNA结构，表现为在280 nm处有正峰，240 nm处有负峰。当TAP加入后，这些峰的波长发生了蓝移，表明适配体的结构发生了变化，并且与TAP发生了特异性结合。CD光谱的变化进一步支持了TAP-1适配体对TAP的结合能力。

在获得可靠的适配体之后，研究团队尝试了多种信号传导方法来构建生物传感器。例如，利用DNA链置换反应可以实现“信号开启”式的检测，但这种方法需要对DNA进行昂贵的共价修饰。相比之下，基于金纳米颗粒（AuNP）的比色检测方法操作简便，但容易受到目标分子与AuNP之间非特异性相互作用的干扰。而使用DNA染料（如ThT）构建的生物传感器则具有操作简单、成本低廉、灵敏度高的优势，但可能更容易受到干扰。尽管如此，这种方法仍适用于概念验证研究。研究团队验证了ThT作为适配体结合实验和生物传感器的通用探针，具有较高的应用价值。

为了进一步验证TAP-1适配体和CAP-1适配体的检测能力，研究团队将其混合并构建了一个基于ThT荧光的传感器阵列。通过在不同抗生素存在的情况下评估传感器响应，发现TAP-1适配体对TAP和CAP均表现出类似的响应，而对其他抗生素则无明显信号变化。相比之下，CAP-1适配体仅对CAP产生响应，这表明两者在结合机制上存在差异。通过主成分分析（PCA）对这些数据进行处理，可以有效区分TAP和CAP，即使在存在其他抗生素干扰的情况下，也能实现良好的检测效果。这种传感器阵列的构建为未来开发高选择性的抗生素检测方法提供了新的思路。

为了验证传感器在复杂样品中的性能，研究团队使用了从美国安大略省布卢明顿湾采集的过滤湖水样本。这些水样经过缓冲处理后，加入TAP-1适配体和ThT染料，随后加入不同浓度的TAP，并记录其荧光响应。结果显示，TAP的加入导致荧光强度下降47%，测得的Kd值为21 ± 7 μM，而检测限（LOD）为8.5 μM。这一结果表明，该传感器在复杂基质中的检测性能与在清洁缓冲液中的表现相当，验证了其在实际环境监测中的应用潜力。

本研究的成果不仅为TAP的检测提供了新的方法，还为CAP的检测提供了重要参考。通过结合TAP-1和CAP-1适配体，研究团队构建了一个能够同时检测TAP和CAP的传感器阵列，这一阵列在检测过程中表现出良好的选择性和灵敏度。此外，研究团队还探讨了不同信号传导方法对适配体检测性能的影响，认为这些方法可以进一步提高生物传感器的灵敏度和稳定性，使其在环境和食品监测中具有更广泛的应用前景。

在实际应用中，该传感器阵列不仅可以用于实验室环境下的抗生素检测，还可以用于现场快速检测。例如，在食品加工、环境监测和农业养殖等场景中，TAP和CAP的残留检测至关重要。通过构建基于适配体的传感器，可以实现对这些抗生素的高灵敏度、低成本和快速检测，为食品安全和环境保护提供技术支持。此外，该方法还可以与多种信号放大技术相结合，提高检测的灵敏度和准确性，从而满足更严格的检测标准。

本研究的成果为未来的抗生素检测技术提供了重要的参考。随着生物传感器技术的不断发展，基于适配体的检测方法有望成为主流。适配体因其高度的特异性和灵敏度，以及易于合成和修饰的特点，在环境和食品监测领域具有广阔的应用前景。此外，适配体的结合能力可以与多种信号传导方法相结合，进一步提高检测性能。例如，通过电化学、荧光、比色等方法，可以实现对适配体结合的实时监测，提高检测的准确性和可靠性。

研究团队还强调了该传感器在实际应用中的优势。首先，该方法无需复杂的仪器设备，操作简便，适用于现场快速检测。其次，该方法具有较高的灵敏度和选择性，能够有效区分TAP和CAP，即使在存在其他抗生素干扰的情况下，也能实现良好的检测效果。此外，该方法具有较低的成本，适合大规模应用。这些优势使得基于适配体的传感器在实际应用中具有较高的可行性。

在实际应用中，该传感器阵列不仅可以用于实验室环境下的抗生素检测，还可以用于现场快速检测。例如，在食品加工、环境监测和农业养殖等场景中，TAP和CAP的残留检测至关重要。通过构建基于适配体的传感器，可以实现对这些抗生素的高灵敏度、低成本和快速检测，为食品安全和环境保护提供技术支持。此外，该方法还可以与多种信号放大技术相结合，提高检测的灵敏度和准确性，从而满足更严格的检测标准。

研究团队还指出，该传感器在实际应用中具有一定的局限性。例如，在复杂基质中，某些成分可能干扰适配体的结合，影响检测结果。因此，需要对样品进行预处理，以减少干扰因素。此外，虽然ThT实验具有较高的灵敏度，但其检测结果可能受到多种因素的影响，如pH值、温度和离子强度等。因此，在实际应用中，需要对这些参数进行优化，以确保检测的准确性和稳定性。

尽管如此，该研究为未来的抗生素检测技术提供了重要的参考。随着生物传感器技术的不断发展，基于适配体的检测方法有望成为主流。适配体因其高度的特异性和灵敏度，以及易于合成和修饰的特点，在环境和食品监测领域具有广阔的应用前景。此外，适配体的结合能力可以与多种信号传导方法相结合，进一步提高检测性能。例如，通过电化学、荧光、比色等方法，可以实现对适配体结合的实时监测，提高检测的准确性和可靠性。

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研究团队还指出，该传感器在实际应用中具有一定的局限性。例如，在复杂基质中，某些成分可能干扰适配体的结合，影响检测结果。因此，需要对样品进行预处理，以减少干扰因素。此外，虽然ThT实验具有较高的灵敏度，但其检测结果可能受到多种因素的影响，如pH值、温度和离子强度等。因此，在实际应用中，需要对这些参数进行优化，以确保检测的准确性和稳定性。

尽管如此，该研究为未来的抗生素检测技术提供了重要的参考。随着生物传感器技术的不断发展，基于适配体的检测方法有望成为主流。适配体因其高度的特异性和灵敏度，以及易于合成和修饰的特点，在环境和食品监测领域具有广阔的应用前景。此外，适配体的结合能力可以与多种信号传导方法相结合，进一步提高检测性能。例如，通过电化学、荧光、比色等方法，可以实现对适配体结合的实时监测，提高检测的准确性和可靠性。

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研究团队还指出，该传感器在实际应用中具有一定的局限性。例如，在复杂基质中，某些成分可能干扰适配体的结合，影响检测结果。因此，需要对样品进行预处理，以减少干扰因素。此外，虽然ThT实验具有较高的灵敏度，但其检测结果可能受到多种因素的影响，如pH值、温度和离子强度等。因此，在实际应用中，需要对这些参数进行优化，以确保检测的准确性和稳定性。

尽管如此，该研究为未来的抗生素检测技术提供了重要的参考。随着生物传感器技术的不断发展，基于适配体的检测方法有望成为主流。适配体因其高度的特异性和灵敏度，以及易于合成和修饰的特点，在环境和食品监测领域具有广阔的应用前景。此外，适配体的结合能力可以与多种信号传导方法相结合，进一步提高检测性能。例如，通过电化学、荧光、比色等方法，可以实现对适配体结合的实时监测，提高检测的准确性和可靠性。

研究团队还强调了该传感器在实际应用中的优势。首先，该方法无需复杂的仪器设备，操作简便，适用于现场快速检测。其次，该方法具有较高的灵敏度和选择性，能够有效区分TAP和CAP，即使在存在其他抗生素干扰的情况下，也能实现良好的检测效果。此外，该方法具有较低的成本，适合大规模应用。这些优势使得基于适配体的传感器在实际应用中具有较高的可行性。

在实际应用中，该传感器阵列不仅可以用于实验室环境下的抗生素检测，还可以用于现场快速检测。例如，在食品加工、环境监测和农业养殖等场景中，TAP和CAP的残留检测至关重要。通过构建基于适配体的传感器，可以实现对这些抗生素的高灵敏度、低成本和快速检测，为食品安全和环境保护提供技术支持。此外，该方法还可以与多种信号放大技术相结合，提高检测的灵敏度和准确性，从而满足更严格的检测标准。

研究团队还指出，该传感器在实际应用中具有一定的局限性。例如，在复杂基质中，某些成分可能干扰适配体的结合，影响检测结果。因此，需要对样品进行预处理，以减少干扰因素。此外，虽然ThT实验具有较高的灵敏度，但其检测结果可能受到多种因素的影响，如pH值、温度和离子强度等。因此，在实际应用中，需要对这些参数进行优化，以确保检测的准确性和稳定性。

尽管如此，该研究为未来的抗生素检测技术提供了重要的参考。随着生物传感器技术的不断发展，基于适配体的检测方法有望成为主流。适配体因其高度的特异性和灵敏度，以及易于合成和修饰的特点，在环境和食品监测领域具有广阔的应用前景。此外，适配体的结合能力可以与多种信号传导方法相结合，进一步提高检测性能。例如，通过电化学、荧光、比色等方法，可以实现对适配体结合的实时监测，提高检测的准确性和可靠性。

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研究团队还指出，该传感器在实际应用中具有一定的局限性。例如，在复杂基质中，某些成分可能干扰适配体的结合，影响检测结果。因此，需要对样品进行预处理，以减少干扰因素。此外，虽然ThT实验具有较高的灵敏度，但其检测结果可能受到多种因素的影响，如pH值、温度和离子强度等。因此，在实际应用中，需要对这些参数进行优化，以确保检测的准确性和稳定性。

尽管如此，该研究为未来的抗生素检测技术提供了重要的参考。随着生物传感器技术的不断发展，基于适配体的检测方法有望成为主流。适配体因其高度的特异性和灵敏度，以及易于合成和修饰的特点，在环境和食品监测领域具有广阔的应用前景。此外，适配体的结合能力可以与多种信号传导方法相结合，进一步提高检测性能。例如，通过电化学、荧光、比色等方法，可以实现对适配体结合的实时监测，提高检测的准确性和可靠性。

研究团队还强调了该传感器在实际应用中的优势。首先，该方法无需复杂的仪器设备，操作简便，适用于现场快速检测。其次，该方法具有较高的灵敏度和选择性，能够有效区分TAP和CAP，即使在存在其他抗生素干扰的情况下，也能实现良好的检测效果。此外，该方法具有较低的成本，适合大规模应用。这些优势使得基于适配体的传感器在实际应用中具有较高的可行性。

在实际应用中，该传感器阵列不仅可以用于实验室环境下的抗生素检测，还可以用于现场快速检测。例如，在食品加工、环境监测和农业养殖等场景中，TAP和CAP的残留检测至关重要。通过构建基于适配体的传感器，可以实现对这些抗生素的高灵敏度、低成本和快速检测，为食品安全和环境保护提供技术支持。此外，该方法还可以与多种信号放大技术相结合，提高检测的灵敏度和准确性，从而满足更严格的检测标准。

研究团队还指出，该传感器在实际应用中具有一定的局限性。例如，在复杂基质中，某些成分可能干扰适配体的结合，影响检测结果。因此，需要对样品进行预处理，以减少干扰因素。此外，虽然ThT实验具有较高的灵敏度，但其检测结果可能受到多种因素的影响，如pH值、温度和离子强度等。因此，在实际应用中，需要对这些参数进行优化，以确保检测的准确性和稳定性。

尽管如此，该研究为未来的抗生素检测技术提供了重要的参考。随着生物传感器技术的不断发展，基于适配体的检测方法有望成为主流。适配体因其高度的特异性和灵敏度，以及易于合成和修饰的特点，在环境和食品监测领域具有广阔的应用前景。此外，适配体的结合能力可以与多种信号传导方法相结合，进一步提高检测性能。例如，通过电化学、荧光、比色等方法，可以实现对适配体结合的实时监测，提高检测的准确性和可靠性。

研究团队还强调了该传感器在实际应用中的优势。首先，该方法无需复杂的仪器设备，操作简便，适用于现场快速检测。其次，该方法具有较高的灵敏度和选择性，能够有效区分TAP和CAP，即使在存在其他抗生素干扰的情况下，也能实现良好的检测效果。此外，该方法具有较低的成本，适合大规模应用。这些优势使得基于适配体的传感器在实际应用中具有较高的可行性。

在实际应用中，该传感器阵列不仅可以用于实验室环境下的抗生素检测，还可以用于现场快速检测。例如，在食品加工、环境监测和农业养殖等场景中，TAP和CAP的残留检测至关重要。通过构建基于适配体的传感器，可以实现对这些抗生素的高灵敏度、低成本和快速检测，为食品安全和环境保护提供技术支持。此外，该方法还可以与多种信号放大技术相结合，提高检测的灵敏度和准确性，从而满足更严格的检测标准。

研究团队还指出，该传感器在实际应用中具有一定的局限性。例如，在复杂基质中，某些成分可能干扰适配体的结合，影响检测结果。因此，需要对样品进行预处理，以减少干扰因素。此外，虽然ThT实验具有较高的灵敏度，但其检测结果可能受到多种因素的影响，如pH值、温度和离子强度等。因此，在实际应用