人工双组氨酸铜肽的稳定性及伪儿茶酚酶活性

《Inorganic Chemistry》：Stability and Pseudocatecholase Activity of Artificial Bis-Histidyl Copper Peptides

本文通过设计含His-His二联体的水溶性肽（Pep1和Pep2），研究了其与Cu(I)/Cu(II)的配位特性及催化邻苯二酚氧化能力。光谱和热力学分析表明，Pep2因丙氨酸间隔子增强配位稳定性，但催化效率与Pep1相当，未发现立体选择性。

　　本研究聚焦于利用4-甲基儿茶酚（4-MC）和L/D-多巴（L/D-Dopa）作为目标底物，进行从头设计的蛋白质合成，旨在探索金属配位位点的催化活性。通过构建两种新的水溶性双组氨酸肽，研究团队成功开发了具有催化能力的生物启发型金属蛋白，这些肽在特定的串联His–His结构和合适的E?′（氧化还原电位）作用下，能够高效地催化儿茶酚氧化反应。该研究为金属酶的开发提供了新的思路，尤其是在铜基配位位点的设计方面。

在这一研究中，团队采用多种分析技术，包括电位滴定、荧光、紫外–可见（UV–vis）和圆二色光谱（CD），对肽与Cu(II)和Cu(I)离子的配位行为进行了系统研究。这些研究结果不仅揭示了催化位点的结构特征，还进一步阐明了这些肽在模拟伪儿茶酚酶活性方面的潜力。通过这些实验，研究者发现，当金属配位到肽的His–His位点时，其稳定性和催化活性均显著增强，这表明His–His配位模式在金属酶开发中具有重要意义。

### 肽的质子化平衡

为了深入理解肽与铜离子的相互作用，研究团队首先对三种肽（Pep1、Pep2和PepCtrl）的质子化平衡进行了研究。通过电位滴定，研究者确定了这些肽在水溶液中的质子化常数。Pep1和Pep2均为五元质子酸，其pKa值与肽序列中主要的酸性基团（如天冬氨酸的羧基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的羟基和赖氨酸的氨基）的脱质子化过程一致。PepCtrl则因不含组氨酸，仅表现出三个质子化常数。研究发现，在pH 7.4时，Pep1和Pep2的主要形式为[H?L]，这表明在这一pH值下，两个组氨酸均处于中性咪唑形式，有助于铜离子的结合。

### 铜(II)/肽复合物的形成

研究团队进一步通过电位滴定和光谱分析，研究了铜(II)与Pep1和Pep2形成复合物的过程。在铜与肽的摩尔比为1:1.2的情况下，仅观察到单核铜(II)/肽复合物的形成，而未出现双金属复合物。在更高的摩尔比（如1.6:1）时，出现了沉淀现象，这表明在过量铜离子存在的情况下，肽可能与铜形成不溶性复合物。通过这些实验，研究者确定了铜(II)/肽复合物的稳定性常数，其中Pep1和Pep2的log β值分别为7.16和7.53，表明它们对铜(II)具有较高的结合能力。

### 铜(II)/肽复合物的光谱特征

为了进一步揭示铜(II)/肽复合物的配位环境，研究团队收集了不同pH值下的可见吸收光谱和圆二色光谱。结果显示，在pH 7.4时，[CuL]是主要的复合物形式，其吸收峰位于584 nm，与文献中报道的铜与组氨酸双位点的结合情况一致。此外，[Cu(LH?)]²⁺和[Cu(LH)]⁺在pH 5.6和6.4时分别达到最大形成量，表明铜(II)的配位环境随pH值的变化而发生改变。在更高的pH值（如pH 7.8以上），[Cu(LH??)]^?成为主要形式，吸收峰向523 nm移动，并保持稳定，直到pH 11。

### 铜(I)/肽复合物的形成

研究团队还通过紫外–可见光谱和荧光滴定，研究了铜(I)与Pep1和Pep2的结合情况。实验结果表明，铜(I)与肽的结合同样遵循1:1的摩尔比，并且在pH 7.4时，其log β值分别为8.98和9.8，显示出与文献中报道的铜与组氨酸双位点的结合情况相似。值得注意的是，PepCtrl对铜(I)的结合能力极低，这与它的结构中不含组氨酸有关。研究团队推测，这种低结合能力可能是由于第二壳层的相互作用较少，或者肽的酸性氨基NH基团的酸性较低。

### 儿茶酚氧化反应的催化活性

研究团队进一步测试了铜–肽复合物对4-MC和L/D-Dopa的催化氧化能力。实验发现，在铜(II)存在的情况下，4-MC的氧化速率显著加快，特别是在加入Pep1或Pep2后，氧化速率进一步提高。通过紫外–可见光谱监测吸收峰的变化，研究者观察到4-MC氧化为4-甲基醌（4-MQ）的产物，其吸收峰位于401 nm。此外，L/D-Dopa的氧化速率在两种对映体之间并未表现出显著差异，这表明这些肽在催化过程中缺乏对映体选择性。然而，研究团队指出，由于这些肽的结构较为灵活，这种缺乏对映体选择性可能是由于第二壳层的氢键作用较弱。

### 铜(I)/肽复合物的催化机制

通过比较实验，研究团队发现，铜–肽复合物对4-MC的催化机制与文献中报道的铜与组氨酸双位点的催化机制相似。在催化反应的初始阶段，铜(II)/肽迅速被还原为铜(I)/肽，随后与第二个4-MC分子结合，并通过分子氧进行氧化反应。该过程需要4个电子，其中由铜(I)提供3个，由第二个4-MC分子提供最后一个电子，最终形成4-MQ。研究团队通过光谱分析和动力学研究，进一步验证了这一机制，并指出，催化反应的速率决定步骤可能与铜与分子氧的结合有关。

### 结论

本研究的结果表明，Pep1和Pep2在铜(I)和铜(II)的结合能力上具有一定的优势，特别是在组氨酸双位点与谷氨酰胺残基之间的空间位阻效应上。通过引入一个丙氨酸残基作为间隔，Pep2的结合能力比Pep1略高，但这种差异并未显著影响其还原电位。研究团队认为，这一结果可能与丙氨酸残基改变了氨基NH基团的酸性有关，也可能与谷氨酰胺残基与组氨酸双位点之间的第二壳层相互作用有关。尽管当前数据无法明确区分这两种效应，但它们的共同作用表明，丙氨酸残基对铜结合能力的提升具有重要作用。

此外，研究团队发现，铜–肽复合物对4-MC的催化氧化能力与文献中报道的铜与组氨酸双位点的催化能力相似，这表明这些肽在模拟生物酶催化反应方面具有潜力。然而，对于L/D-Dopa的氧化反应，研究团队并未观察到显著的对映体选择性，这可能与这些肽的结构灵活性有关。研究团队认为，在未来的实验中，可以通过对重组的Spy蛋白进行进一步研究，以探讨这些铜结合位点是否能够表现出对映体选择性。

综上所述，本研究通过系统分析铜–肽复合物的形成、稳定性和催化活性，为金属酶的设计提供了新的思路。研究团队不仅揭示了组氨酸双位点在铜结合和催化中的重要作用，还探讨了丙氨酸残基对铜结合能力的影响。这些发现为开发铜基生物启发型人工金属酶提供了重要的理论依据和实验数据，具有重要的科学意义和应用前景。