一种基于逆电子需求的Diels–Alder反应方法，用于选择性检测活细胞中的乙醛

《Journal of the American Chemical Society》：An Inverse Electron-Demand Diels–Alder Approach to Selective Activity-Based Sensing of Acetaldehyde in Living Cells

乙醛特异性荧光探针的理性设计与活细胞成像验证，通过逆电子需求Diels-Alder反应实现高效检测与代谢动态监测。

　　乙醛（Acetaldehyde, AA）是一种具有高度反应性和毒性的两碳代谢物，主要在细胞内作为乙醇氧化的中间产物生成。当乙醛未能被有效代谢时，其水平升高会引发DNA、蛋白质和脂质的异常损伤，从而增加癌症、肝炎和肝硬化的发病风险。传统的乙醛检测方法往往需要破坏样本或进行复杂的预处理，这在空间和时间分辨率上有所妥协，或者对乙醛与其他竞争性醛类和反应性碳物种的检测选择性不足。为克服这些限制，我们设计并合成了一种荧光探针平台，专门用于乙醛的活性基检测，以实现对生理相关浓度的乙醛在水溶液和活细胞中的高选择性检测，同时减少其他生物分析物的干扰。

乙醛的反应性和毒性使其在细胞内具有显著的生物效应。它能够与DNA、蛋白质和脂质形成共价加合物，干扰生物分子的功能，引发氧化应激和基因组不稳定。在某些情况下，乙醛还会诱导DNA-蛋白质交联和致突变的DNA损伤，从而干扰复制和修复过程，最终促进癌变。此外，乙醛会破坏线粒体功能，通过损害膜完整性并增加活性氧（ROS）的产生，进而影响细胞的能量代谢。在乙醛脱氢酶2（ALDH2）活性受损的个体中，如东亚人群中常见的ALDH2*2变异者，乙醇摄入后乙醛会积累至细胞毒性水平，显著增加组织损伤和与酒精相关的疾病风险，包括肝损伤和上消化道癌症。

乙醛在血液中的基础浓度为1-3 μM，而在酒精摄入后，其浓度可超过100 μM，甚至在细胞内达到500 μM以上。因此，研究乙醛在健康和疾病状态下的生物学作用具有重要意义。为了深入理解乙醛的贡献，需要开发新的化学工具来研究这一反应性碳物种（RCS）在生物系统中的行为。活性基检测（ABS）作为一种强大的方法，已被广泛用于这一领域。例如，我们与Chan实验室分别开发了基于ABS策略的乙醛特异性成像方法，利用甲醛诱导的2-aza-Cope反应。此外，Lin及其团队也报道了用于甲醛检测的formimine和aminal开关机制。Spiegel及其团队则开发了用于甲基glyoxal（MGO）检测的荧光探针，利用二胺缩合反应。最近，Raj团队采用2-氨基噻吩醇结构监测活系统中的总醛池。

尽管在该领域取得了显著进展，但乙醛的特异性监测仍然是一个挑战。这一困难源于乙醛相较于其他相关醛类电子亲和力较低，以及其分子结构中的甲基基团导致更大的空间位阻。因此，乙醛与亲核试剂的反应性不如其他醛类。基于此，我们报告了一种通用的活性基检测方法，用于乙醛的高选择性检测，该方法基于逆电子需求的Diels-Alder（IEDDA）反应。该平台能够选择性地监测活细胞中的乙醛池，并为研究酒精相关的病理和生理提供先进的工具。

我们通过合成一种基于四嗪的底物，并评估其在不同胺核试剂存在下的反应性，来探索乙醛的检测方法。我们假设四嗪基团能够通过IEDDA反应快速捕获形成的烯胺中间体，但我们也认为不同胺核试剂在形成烯胺中间体时可能表现出不同的反应性。我们评估了多种类型的胺核试剂，包括不同的脂肪族和芳香族胺。实验结果表明，使用吡咯烷作为三组分反应体系中的反应基团，能够在2小时内实现定量产率。然而，己胺和苯胺在形成与乙醛反应所需的烯胺中间体时效率较低，即使在高温下也是如此。为进一步确认吡咯烷基团相较于其他胺类的优越反应性，我们将不同胺基团引入四嗪基团中。其中，仅带有二级胺基团的探针显示出对乙醛的响应。

在确定吡咯烷基团作为合适的反应基团后，我们进一步研究了连接胺和四嗪基团的链接器对荧光染料支架的影响。乙醛探针（AAPs）通过将香豆素衍生的腈与Boc保护的2-(吡咯烷-2-基)乙腈在氢化物存在下进行缩合反应，随后进行Boc脱保护得到。动力学分析显示，AAP-1和AAP-2在目标乙醛的检测中表现出相似的响应。相比之下，AAP-3表现出显著不同的行为，其产物仅在60°C时观察到。这些探针之间的显著反应性差异表明，通过调整四嗪和胺基团上的取代基，可以进一步优化探针性能。

我们进一步评估了AAP-1对其他生物RCS的响应情况。在这一背景下，甲醛和甲基glyoxal在细胞中的浓度分别为50 μM和1-5 μM。AAP-1在高于生理浓度的甲醛（1 mM）或甲基glyoxal（100 μM）存在下表现出最小的响应，这表明该探针系统对乙醛具有高度特异性。此外，AAP-1对乙醛的选择性优于其他可能的竞争性生物RCS，即使在高浓度下，包括4-羟基壬烯醛、草酰乙酸和脱氢抗坏血酸，以及简单的含羰基分子如丙酮酸、丙醛、己醛、庚醛和丙酮。我们还测试了AAP-1在细胞中可能遇到的氧化和还原条件，如过氧化氢（100 μM）和谷胱甘肽（5 mM），但未观察到荧光变化，进一步验证了AAP-1对乙醛的高选择性。

为总结AAP-1对乙醛的高选择性，图3B展示了当AAP-1与代表性RCS反应时形成的关键中间体。在“结合阶段”，所有醛类都能与AAP-1发生可逆的缩合反应；然而，在“活性阶段”，由甲醛或甲基glyoxal衍生的中间体由于缺乏电子丰富的烯烃基团而无法进一步反应。对于长链分析物，虽然也能通过与AAP-1的反应形成烯胺中间体，但由较大醛类形成的加合物会由于空间位阻而减缓后续的IEDDA反应。为了更好地理解AAP-1对两碳乙醛相对于长链醛的选择性，我们进行了密度泛函理论（DFT）计算。结果表明，由长链醛形成的烯胺中间体的反应能垒比由乙醛形成的高约2.1 kcal/mol，这表明AAP-1对乙醛的检测具有更高的选择性，这一结果与我们的观察一致。

在确认AAP-1的IEDDA触发机制能够选择性地检测生理浓度的乙醛后，我们进一步评估其在活细胞中可视化乙醛池变化的能力。使用共聚焦显微镜（图4），我们对A375细胞进行了处理，使用10 μM AAP-1孵育30分钟，随后用不同浓度的乙醛（最低为100 μM）进行处理，以模拟酒精摄入后的乙醛水平。这些处理导致乙醛处理细胞的荧光显著增加，且呈剂量依赖性，表明AAP-1能够检测活细胞中的乙醛变化。为了排除由相关RCS引起的背景荧光，我们进行了对照实验，使用甲醛和甲基glyoxal这两种在细胞中常见的生物相关醛类。在处理100 μM的甲醛或甲基glyoxal后，荧光信号与未处理的对照细胞相似，表明没有显著的探针激活。这些结果为AAP-1对乙醛的高化学选择性提供了有力证据，表明其能够在生理相关浓度下区分乙醛与其他内源性RCS。

乙醛在乙醇代谢过程中积累最为显著，其中乙醇首先被酒精脱氢酶（ADH）氧化生成乙醛，随后被乙醛脱氢酶（ALDH）转化为乙酸，最终代谢为二氧化碳和水。因此，研究乙醛在乙醇代谢中的动态变化具有重要意义。我们使用Huh7细胞系进行实验，因为其高表达ADH酶。在1 mM乙醇处理1小时后，AAP-1的荧光信号呈剂量依赖性增加。已知的ADH抑制剂Fomepizole能够有效阻断乙醇转化为乙醛的酶促反应（图4D）。同时处理乙醇和Fomepizole显著抑制了AAP-1的激活，荧光信号与基础水平相当。相反，抑制ALDH会导致乙醛在细胞内积累，进一步增强AAP-1的荧光信号（图4E）。这些数据表明，AAP-1能够作为特定的荧光报告工具，用于监测细胞内的乙醇代谢，为研究以乙醛为中心的动态两碳生物学提供了宝贵的工具。

综上所述，我们已经证明AAP-1是一种稳健且灵敏的荧光探针，能够用于乙醛的活性基检测。通过利用基于IEDDA的激活机制和引入四嗪淬灭剂，AAP-1能够在溶液和活细胞环境中实现对乙醛的选择性检测。我们进一步验证了AAP-1对细胞中乙醛水平变化的响应能力，包括通过外源性乙醛添加或通过调节乙醇代谢实现的内源性乙醛变化。这项研究为AAP-1及其相关活性基检测化学工具在研究醛类生物学中的广泛应用提供了起点。