一种催化非核糖体肽链延伸的连接酶对氨基酰-tRNA的特异性

《Journal of the American Chemical Society》：Aminoacyl-tRNA Specificity of a Ligase Catalyzing Non-ribosomal Peptide Extension

氨基酸酰基tRNA连接酶（PEARLs）的底物特异性研究。利用flexizyme合成系列非天然aa-tRNA，探究BhaB_CAla对氨基酸和tRNA结构的双重识别机制。结果显示酶催化肽链延伸时，氨基酸种类（如甘氨酸、β-丙氨酸等）和tRNA acceptor茎及反密码子臂均影响特异性，但对氨基酸具有容忍性，为酶工程改造提供基础。

　　肽氨基酸转移核糖核酸连接酶（PEARLs）是一类能够通过使用氨基酸连接的核糖核酸（aa-tRNA）形成酰胺键的酶，它们通过延长肽链的主链来参与肽和蛋白质的合成。在本研究中，我们探讨了PEARL BhaB_C^Ala的底物特异性，该酶天然使用Ala-tRNA^Ala。为了更全面地解析这一酶的底物范围，我们利用了一种名为flexizyme的核酶，这种核酶能够将多种活化的氨基酸连接到目标tRNA上。通过生成一系列带有不同氨基酸和tRNA的aa-tRNA变体，我们进一步揭示了BhaB_C^Ala对底物的识别机制。

酰胺键的形成是合成肽和蛋白质类药物的重要步骤。传统的合成方法包括固相或液相肽合成，以及通过核糖体翻译实现。然而，近年来对生物催化方法的兴趣增加，为将能够形成酰胺键的酶引入合成过程提供了新的可能性。酶催化合成不仅具有良好的可扩展性，还能实现高效率、高选择性和减少废弃物的产生。PEARLs作为形成酰胺键的酶之一，利用aa-tRNA在肽链的C末端形成新的酰胺键。尽管已有研究关注PEARLs对肽底物的识别，但对aa-tRNA底物特异性的决定因素仍然不清楚。

在本研究中，我们选择了一种来自Bacillus halodurans的代表性PEARL，即BhaB_C^Ala，并利用flexizyme生成多种带有不同氨基酸的aa-tRNA变体，以评估该酶的底物特异性。通过这些实验，我们发现BhaB_C^Ala能够在多种氨基酸（包括蛋白质氨基酸、非蛋白质氨基酸、羟基酸和巯基羧酸）连接到tRNA^Ala时催化肽链的延长，但这些底物的反应效率通常低于天然的Ala-tRNA。这表明，酶对氨基酸本身具有一定的识别能力，同时对tRNA结构也有一定的依赖性。

为了验证这一结论，我们首先利用flexizyme生成Ala-tRNA^Ala（UGC）的变体，而不是使用传统的氨基酸连接酶（如AlaRS）。通过实验，我们发现即使flexizyme生成的aa-tRNA中含有一定比例的未连接的tRNA（约为65%），该酶仍然能够有效地催化反应，且反应效率随着aa-tRNA浓度的增加而提高，最终达到完全修饰。这一结果表明，flexizyme生成的aa-tRNA可以用于BhaB_C^Ala的反应体系，尽管存在竞争性抑制的可能。

在进一步的实验中，我们评估了多种非天然氨基酸连接到tRNA^Ala（UGC）时的反应情况。结果表明，BhaB_C^Ala能够高效地将β-Ala连接到肽链，而对^d-Ala的反应效率较低。此外，我们没有观察到Aib或N-Me-Ala能够被该酶识别并催化反应。这一结果提示，虽然BhaB_C^Ala对某些非天然氨基酸具有一定的容忍度，但其对氨基酸的识别能力仍然是关键因素。

为了进一步探讨tRNA结构对酶识别的影响，我们利用flexizyme将Ala连接到不同序列的tRNA上，并评估了BhaB_C^Ala的反应效率。结果表明，来自P. syringae的Cys-tRNA（GCA）和E. coli的Trp-tRNA（CCA）作为底物时，反应效率显著低于天然的Ala-tRNA。通过将这些tRNA的特定区域替换为E. coli的Ala-tRNA（UGC）结构，我们发现D臂和T茎的替换能够提高反应效率，但当替换的是抗密码子臂时，反应效率则大幅下降。这表明，抗密码子臂在酶识别过程中起着重要作用。

此外，我们还评估了接受子茎对BhaB_C^Ala活性的影响。结果表明，将P. syringae的Cys-tRNA（U71A）中的接受子茎替换为与E. coli的Ala-tRNA相同的识别碱基，能够显著提高酶的活性。进一步的实验显示，当将抗密码子的第二和第三位碱基替换为与E. coli的Ala-tRNA一致时，酶的活性进一步增强。这表明，抗密码子的碱基序列和识别碱基在酶对tRNA的识别中具有重要作用。

为了更直观地理解这些结构特征如何影响酶的识别，我们利用AlphaFold3模型构建了BhaB_C^Ala、BhaA和E. coli的Ala-tRNA（UGC）的复合结构模型。模型显示，该酶主要与tRNA的接受子茎和抗密码子臂相互作用，同时识别碱基和抗密码子序列也对识别起到辅助作用。这一发现与之前对其他PEARLs的研究结果一致，例如BhaB_C^Trp与E. coli的Trp-tRNA的相互作用，以及AmmB₄^Arg与Arg-tRNA的相互作用。这些模型支持了我们关于tRNA结构对酶识别的重要性的结论。

值得注意的是，尽管所有tRNA分子都是通过体外转录获得的，我们仍不能排除后转录修饰可能对酶的识别能力产生影响。然而，体外实验表明，BhaB_C^Ala能够在多种氨基酸连接到tRNA^Ala的情况下催化肽链的延长，并且能够催化形成酯键和硫酯键等非酰胺键。这些结果为未来通过定向进化方法开发能够高效催化多种氨基酸连接的PEARL变体提供了理论基础。

综上所述，本研究通过利用flexizyme生成多种非天然的aa-tRNA变体，揭示了BhaB_C^Ala对底物的识别机制。我们发现，该酶对底物的识别不仅依赖于氨基酸本身，还依赖于tRNA的结构特征，特别是抗密码子臂和接受子茎。这些结构特征的识别能力为未来在肽合成领域中工程化这些酶提供了新的方向。此外，体外实验的结果也表明，这些酶具有一定的灵活性，能够在多种底物条件下发挥作用，为更广泛的应用奠定了基础。