一种化学机制路径为细胞中 argpyrimidine 的生成指明了方向

《Journal of the American Chemical Society》：A Chemical Mechanistic Path Leads the Way to Cellular Argpyrimidine

本研究通过肽模型系统和质谱分析，揭示了Argpyrimidine（APY）的形成机制，发现[M+144]中间体是APY的前体，并通过温度和pH实验排除了氧化脱羧步骤。进一步证明邻近的Tyr、磷酸化Ser/Tyr可促进APY形成，并在细胞蛋白组学中发现磷酸化与APY形成的关联。

　　APY（Argpyrimidine）是一种由甲基glyoxal（MGO）衍生而来的高级糖化终产物（AGEs），它在多种疾病中被发现具有潜在的病理相关性。然而，由于APY的形成过程不依赖于酶催化，因此在确定其在蛋白质和细胞内的分布以及形成机制方面一直面临巨大挑战。本研究通过使用肽模型系统和质谱分析，深入探讨了APY的化学形成机制，并揭示了其与细胞内磷酸化事件之间的潜在联系。这些发现不仅为APY的形成提供了新的理解，还可能为开发新的化学或荧光工具以预测、检测和研究活细胞中的糖化事件提供重要的基础。

APY在蛋白质中主要形成于精氨酸残基上，其形成过程涉及多个复杂的化学步骤。此前，人们提出了几种可能的形成机制，包括还原酮的形成和氧化脱羧作用。然而，本研究通过实验验证，发现这些机制并不适用于APY的形成。研究团队发现，APY的形成并不需要氧化步骤，而是通过一个形式上的氧化步骤被替代，同时释放出甲酸作为副产物。此外，邻近的酪氨酸（Tyr）可能在APY的形成过程中起到一般碱的作用，促进反应的进行。值得注意的是，即使引入了额外的负电荷，磷酸化的酪氨酸或丝氨酸（Ser）残基仍然能够显著促进APY的形成，这与之前的研究结论相矛盾，表明磷酸化可能在糖化过程中起到促进作用，抵消了其通常被认为会抑制糖化的负电荷效应。

为了进一步验证这些机制，研究团队在活细胞中进行了定量蛋白质组学分析，使用HEK-293T细胞作为模型。通过将细胞裂解物进行胰蛋白酶消化并使用TMT（Tandem Mass Tags）进行标记，他们能够对多种AGE进行定量分析，包括APY、[M + 144]类AGE（如THP）以及其他常见的AGE（如MGH异构体和CEA）。结果表明，在MGO处理的细胞中，APY和[M + 144]类AGE是主要的糖化产物，且这些AGE修饰的蛋白质与磷酸化相关的术语（如激酶活性）有显著关联。这提示了APY的形成可能与细胞内的磷酸化过程存在某种形式的交叉作用。

通过详细的GO（Gene Ontology）分析和功能注释聚类分析，研究团队发现APY修饰的蛋白质与磷酸化相关的生物过程和分子功能具有高度的相似性。例如，APY修饰的蛋白质涉及ATP结合、激酶活性以及组蛋白激酶活性等过程。而其他AGE修饰的蛋白质则未表现出类似的磷酸化相关特征。这些发现进一步支持了APY形成与磷酸化之间的潜在联系，并表明这种联系可能在细胞内具有重要的生物学意义。

研究团队还通过合成包含磷酸化残基的肽，验证了磷酸化对APY形成的影响。实验结果显示，即使在引入额外负电荷的情况下，磷酸化的酪氨酸或丝氨酸仍能显著促进APY的形成。这种效应在不同温度和pH条件下均被观察到，表明磷酸化可能通过改变局部化学环境，影响AGE的形成路径。例如，在较高pH条件下，APY的形成显著增强，而磷酸化可能通过调节局部电荷分布，促进或偏向特定的AGE生成。

研究结果表明，APY的形成并非完全依赖于MGO的浓度，而是受到多种因素的影响，包括肽序列、反应条件（如pH和温度）以及邻近的化学环境。这些发现为理解APY在细胞内的形成提供了新的视角，并强调了磷酸化在调节糖化过程中的重要性。此外，APY的形成过程似乎涉及一个较高的能量激活壁垒，而温度的升高能够促进这一过程，使其成为主要的AGE。

研究还指出，APY在活细胞中的形成可能与磷酸化事件密切相关，这为未来的生物学研究提供了新的方向。例如，磷酸化可能通过改变局部化学环境，影响糖化反应的路径，进而影响特定的AGE生成。这一发现可能有助于开发新的化学工具，用于检测和调控细胞内的糖化事件，特别是在APY形成方面。此外，APY的稳定性使其成为研究糖化过程的理想靶标，因为它在细胞内可以长期存在，从而提供更可靠的实验数据。

本研究的另一个重要发现是，APY的形成可能与甲酸的释放有关。甲酸是一种在细胞代谢中重要的反应性物质，其生成可能与糖化过程中的某些化学步骤相关。通过检测反应中甲酸的生成，研究团队确认了APY形成过程中确实释放了甲酸，这与他们提出的机制相吻合。此外，他们还发现，即使在没有氧气的条件下，APY的形成仍然可以发生，这进一步排除了氧化脱羧作用作为APY形成必要步骤的可能性。

综上所述，这项研究不仅揭示了APY的形成机制，还为理解糖化与磷酸化之间的潜在联系提供了重要的实验依据。通过结合肽模型系统和活细胞分析，研究团队展示了磷酸化如何通过改变局部化学环境，促进APY的形成。这些发现对于未来研究APY在细胞内的作用及其与疾病的关系具有重要意义，并可能为开发新的生物标志物和调控工具提供理论基础。此外，研究结果也表明，APY的形成是一个复杂的化学过程，涉及多个中间体和化学步骤，其机制的深入解析有助于更全面地理解糖化反应在生物体内的作用。