塑造糖链结构：碳水化合物活性酶引发的连接方式变化与环状结构畸变之间的隐藏关系

《Journal of the American Chemical Society》：Shaping the Glycan Landscape: Hidden Relationships between Linkage and Ring Distortions Induced by Carbohydrate-Active Enzymes

糖苷酶通过空间约束和动态效应诱导糖链构象变化，其中MII通过Zn2?和Asp残基促进M5G0在?1位的扭曲，形成活性构象；而MI因Ca2?和不同残基布局，使M9构象变化不显著。研究揭示了糖链全局构象与局部环扭曲的关联性，为设计选择性抑制剂提供理论依据。

　　糖基活性酶（CAZymes）在糖基重塑过程中起着关键作用，它们通过形成和断裂糖苷键来改变糖链的结构。糖苷酶这类CAZymes在催化机制中经常观察到一种现象，即单糖环的扭曲，这种扭曲将底物从稳定的溶液构象转变为具有反应活性的构象。然而，这种扭曲是由酶结合位点的立体化学约束所驱动，还是由更难以捉摸的糖链构象灵活性带来的动态效应，目前仍存在争议。为了更深入地理解这一问题，本研究采用增强采样分子动力学（MD）模拟方法，量化糖链在CAZyme结合过程中所经历的构象相空间变化。研究结果揭示了糖链中糖苷键的扭转自由度与曼诺糖环在-1结合位点的pucker自由度之间存在一种新的相关性，尤其是在结合到高尔基α-甘露糖苷酶II（MII）时。关键因素包括与带正电的天冬氨酸残基和催化位点中的Zn2?离子的紧密相互作用。相比之下，与内质网α-甘露糖苷酶I（MI）的比较研究表明，其机制有所不同，其中M9糖链底物的扭转构象和环的扭曲之间没有相关性。

CAZymes在不同糖链之间的特异性结合能力是其进化的重要特征之一。在特定情况下，GH酶催化过程中，糖链底物常在与糖苷键断裂点相邻的-1结合位点发生环的扭曲。这种环的扭曲对于实现糖苷键的轴向取向至关重要，从而促进S_N2反应，无论该反应是逆向还是保留的。尤其是在甘露糖苷酶中，糖环会采取一种避免与催化亲核试剂发生立体位阻的构象。这种反应路径可能因底物不同或GH家族的不同而有所变化，但大多数反应中，环的扭曲往往远离溶液中最稳定的环形构象，如4C₁和1C₄。

尽管对CAZymes的催化路径已有大量研究，但关于环的扭曲如何引发反应前的糖链底物仍存在基本问题。当前的实验研究主要依赖于晶体结构或通过突变晶体结构稳定下的糖苷-酶中间体，这些实验未能捕捉糖链底物的全局构象相空间。因此，糖链在结合过程中的动态过程仍不清楚。计算方法，如全原子分子动力学模拟，提供了研究这一问题的潜力，前提是力场参数能够准确模拟糖苷复合物的环形扭曲。对于MII，GLYCAM06j力场已被证明可以捕捉这种行为。然而，对于其他CAZymes，特别是MI，由于模拟时间尺度较短，难以量化整个糖链的构象相空间。因此，本研究采用了一种增强采样MD模拟方法，即REST-RECT方法，该方法能全面采样糖链的构象相空间，并利用大量计算资源，获得数十微秒的模拟轨迹。

REST-RECT方法结合了哈密顿量副本交换法（REST2）和副本交换与集体变量温控法（RECT），后者基于良好的温控元动力学（WT-MetaD）。该方法已在之前的研究中成功应用于糖链，并在此研究中用于所有模拟系统。模拟系统包括天然或突变的CAZymes与它们的天然底物，如M5G0和M9。初始结构和力场参数通过CHARMM-GUI生成，设置pH为7.0，并保持糖链的结构和组成。所有模拟系统均采用水分子层进行溶剂化，并通过K?或Cl?离子进行电荷中和。此外，还构建了自由糖链在溶液中的模拟系统，以进一步分析其构象变化。

在模拟过程中，采用GROMACS 2022并结合PLUMED包进行计算。力场的选择经过REST-RECT测试模拟验证，确保其能够准确模拟糖链的环形扭曲行为。具体而言，对于MII和MI，分别采用GLYCAM06j力场和AMBER力场。通过能量最小化和平衡模拟，确保了模拟系统的稳定性。所有模拟均在NPT系综下进行，以保持温度和压力的恒定。此外，模拟中还应用了距离约束，以防止糖链从酶的结合位点扩散出去，从而保证了构象采样的有效性。

通过REST-RECT方法，我们能够有效地采样和量化糖链在不同条件下的构象变化。研究结果表明，M5G0在溶液中主要采用4C₁椅型构象，而结合到MII后，其环形构象发生变化，出现了新的能量最小值，即E₅/OH₅构象。这一变化是由于酶结合位点对糖链构象的限制，以及催化位点中Zn2?离子和带正电的天冬氨酸残基的相互作用。通过分析不同突变体（如D341A、D204A、D92A和D472A）对糖链构象的影响，我们进一步验证了这些因素在环形扭曲中的关键作用。例如，D204A突变导致糖链的环形构象未发生改变，而D341A突变则导致环形构象的变化，这与实验结果一致。

此外，我们还探讨了糖链的全局构象对环形扭曲的影响。通过主成分分析（PCA）方法，我们发现M5G0在溶液中可以采用多种构象，而在结合到MII后，其构象被显著限制，仅保留两种主要的构象（#1*和#2*）。这种限制与酶结合位点的结构特性密切相关。相比之下，MI的催化过程中，M9的环形构象与糖链的全局构象之间没有明显的相关性，这表明不同CAZymes可能具有不同的机制来诱导环形扭曲。

通过这些研究，我们不仅揭示了糖链构象变化与环形扭曲之间的关系，还为设计针对糖基化相关疾病的特异性抑制剂提供了理论依据。研究结果表明，MII的催化活性依赖于其结合位点中特定的残基和离子，如Zn2?和D341。这些因素不仅影响糖链的构象，还促进其环形扭曲，从而为酶活性提供必要的条件。此外，通过分析不同糖链的构象变化，我们还发现，即使在相同的酶催化位点，不同的糖链也可能表现出不同的反应路径和构象特征。这些发现为理解CAZymes的特异性与效率提供了新的视角，并为未来开发更有效的抑制剂奠定了基础。