对7指锌指核酸酶的改造提高了人类细胞中基因组编辑的效率

《ACS Bio & Med Chem Au》：Manipulation of 7-Finger Zinc Finger Nuclease Increases the Efficiency of Genome Editing in Human Cells

基因组编辑效率提升及结构优化研究。采用模块组装技术构建7指锌指核酸酶（ZFN），通过V137K突变显著提高AAVS-1和B2M靶点的基因组编辑效率达19%，同时降低脱靶效应。结构建模显示7指ZFN具有更高稳定性，其编辑效率与CRISPR-Cas9相比仍有提升空间。

　　基因编辑技术在医学领域具有巨大的应用潜力，尤其是在基因治疗、疾病模型构建和精准医疗等方面。目前，常用的基因编辑工具包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子类效应核酸酶（TALENs）以及CRISPR-Cas9系统。其中，ZFNs因其较小的体积，相较于TALENs和CRISPR-Cas9，更适合通过病毒载体进行递送，尤其是在载荷空间有限的情况下，例如腺相关病毒（AAV）载体。此外，ZFNs的专利已于2020年到期，因此在临床应用中无需支付高昂的专利授权费用，这使得其在工业和商业层面具有更大的经济可行性。然而，尽管ZFNs的构建在某些情况下较为高效，但目前仍然存在一些技术瓶颈，特别是在构建具有更高特异性的7指ZFNs方面。

在基因编辑工具中，ZFNs通常由多个锌指结构域（ZFs）组成，每个ZF结构域能够识别3个DNA碱基。通过将左右两个ZFN结构域连接起来，可以实现更广泛的DNA识别能力。例如，6指ZFNs可以识别18个DNA碱基，而7指ZFNs理论上可以识别21个碱基，从而提供更高的特异性。然而，由于7指ZFNs的构建难度较大，其基因编辑效率通常低于6指ZFNs。因此，如何有效构建并提高7指ZFNs的效率成为当前研究的重要方向。

为了克服这一挑战，研究人员尝试通过模块化组装的方法构建7指ZFNs，并结合特定的突变来增强其性能。其中，V137K突变在某些情况下被证明能够显著提高ZFNs的基因编辑效率。例如，在构建R7F ZFNs时，V137K突变不仅提高了其识别DNA的能力，还降低了脱靶效应的发生率，使得7指ZFNs在特异性方面优于6指ZFNs。这一发现为更安全、更精准的基因编辑提供了新的思路。

在构建7指ZFNs的过程中，研究人员还利用了多种生物分子建模工具，如AlphaFold、Coot和Rosetta，以优化ZFN-DNA的相互作用。通过这些工具，可以更准确地预测ZFNs的结构，并评估其与DNA结合的稳定性。例如，在R7F ZFN的建模中，研究人员发现V137K突变显著降低了复合物的总能量，表明其结构更加稳定。这种稳定性可能有助于提高基因编辑的效率，同时减少不必要的脱靶效应。

此外，研究人员还探索了不同位置的突变对ZFNs性能的影响。例如，在L7F ZFN中引入V137K突变并未显著提高基因编辑效率，这表明该突变对R7F ZFN的优化更为关键。通过比较不同突变策略的效果，研究人员发现，结合多个V到K的突变（如在多个指中引入V137K或V193K）可以进一步提高7指ZFNs的基因编辑效率。例如，引入V137K和V193K突变的ZFNs在某些实验中表现出约6%的效率提升，而仅引入V137K突变的ZFNs则表现出约4%的提升。这表明，多点突变策略可以更有效地优化7指ZFNs的性能。

在实际应用中，研究人员还测试了7指ZFNs在原代细胞中的基因编辑效果。例如，在针对AAVS-1和B2M基因的7指ZFNs中，其基因编辑效率分别为7–8%和3–4%。这表明，尽管7指ZFNs的效率较低，但通过优化策略仍可在一定程度上提高其性能。同时，这些ZFNs在原代细胞中表现出良好的靶向能力，为未来在体内基因治疗中的应用提供了可能性。

为了进一步比较7指ZFNs与CRISPR-Cas9系统的效率，研究人员还构建了针对AAVS-1的CRISPR-Cas9质粒，并将其与7指ZFNs进行对比。结果显示，CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率高于7指ZFNs，这表明尽管ZFNs在某些方面具有优势，但CRISPR-Cas9系统在整体效率上仍然更胜一筹。因此，如何在保持ZFNs特异性优势的同时提高其效率，仍是未来研究的重点。

此外，研究人员还利用TIDE分析（Tracking of Indels by Decomposition）来评估7指ZFNs的脱靶效应。结果显示，7指ZFNs在引入V137K突变后，其脱靶效应显著降低，甚至低于6指ZFNs。这一发现表明，通过特定的突变策略，可以有效减少ZFNs在基因编辑过程中的非特异性损伤，从而提高其安全性。

综上所述，7指ZFNs在基因编辑领域展现出独特的潜力，尤其是在提高特异性方面。尽管其构建难度较大，但通过模块化组装和特定的突变策略，可以有效提高其效率。同时，结合生物分子建模工具，可以更精确地预测和优化ZFNs的结构，使其在实际应用中更加稳定和高效。这些研究不仅为ZFNs的进一步发展提供了理论支持，也为未来在医学和生物技术领域的应用奠定了基础。