异常的S293位点磷酸化驱动Tau蛋白重复序列R2的寡聚化：来自分子动力学模拟的见解

《ACS Chemical Neuroscience》：Aberrant S293 Phosphorylation Drives Oligomerization of Tau Repeat R2: Insights from Molecular Dynamics Simulations

磷酸化增强tau R2肽寡聚化作用，S293磷酸化通过钠离子桥接促进β-折叠形成及分子间相互作用，与S289磷酸化诱导结构转变不同，其促进效应更显著，为靶向磷酸化位点的抑制剂设计提供依据。

　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种影响全球数亿人的神经退行性疾病，其主要特征是大脑中出现神经纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）和淀粉样斑块（amyloid plaques）。尽管目前尚无根治方法，但对疾病机制的深入理解对于开发新的治疗策略至关重要。在AD患者的大脑中，一种异常的磷酸化现象被广泛观察到，而这种现象在健康大脑中并不存在。这种异常磷酸化主要涉及tau蛋白，其在正常情况下发挥着稳定微管（microtubules, MTs）和维持神经元结构的重要生理功能。然而，当tau蛋白在特定位置发生异常磷酸化时，它会失去对微管的亲和力，进而形成有毒的寡聚体和纤维状结构，最终导致神经细胞死亡和认知功能下降。

在本研究中，我们聚焦于tau蛋白的重复结构域R2，特别是其在S293位点的异常磷酸化（pS293）对寡聚化过程的影响。tau蛋白的R2结构域包含多个可被磷酸化的位点，其中S289和S293的磷酸化已被确认为AD特有的异常磷酸化现象。在之前的实验中，我们发现S289位点的磷酸化显著促进了R2结构域的寡聚化，通过增强分子间的相互作用和β折叠结构的形成。在本研究中，我们进一步探讨了S293位点的磷酸化对R2结构域寡聚化的影响，并发现其同样具有促进寡聚化的功能，但与S289位点的磷酸化在分子机制上存在差异。

首先，我们通过分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟方法，对磷酸化S293的R2肽（pS293R2）与未磷酸化的R2肽（wtR2）的结构特性进行了比较。研究结果显示，pS293R2肽的构象更为紧凑，其均方根偏差（RMSD）和回转半径（Rg）均低于wtR2。这表明，S293位点的磷酸化显著增强了R2肽的内部相互作用，使其结构更加有序。此外，磷酸化还导致了溶剂可及表面积（SASA）的减少，进一步验证了其对构象变化的促进作用。通过分析R2肽的二级结构含量，我们发现pS293R2的β折叠比例显著增加，而螺旋和无规卷曲的比例则有所下降。这一结果表明，S293位点的磷酸化不仅增强了分子内部的相互作用，还促进了β折叠结构的形成，从而推动了R2肽的寡聚化过程。

在分子间相互作用方面，我们观察到磷酸化S293的R2肽（pS293R2）与未磷酸化的R2肽（wtR2）形成二聚体时，表现出更强的分子间相互作用。这种相互作用不仅体现在侧链-侧链接触频率的增加，还表现为氢键相互作用的增强。在二聚体系统中，我们发现pS293R2与pS293R2之间的相互作用最为显著，其β折叠结构和构象紧凑性均高于其他系统。这种现象与S289位点的磷酸化在二聚体系统中所表现出的增强作用类似，但两者的具体影响方式有所不同。S289磷酸化主要通过促进分子间的相互作用来增强寡聚化，而S293磷酸化则在分子间和分子内相互作用方面均表现出增强作用，并且其对二级结构的影响更为广泛。

值得注意的是，钠离子（Na?）在pS293R2二聚体中扮演了关键角色。我们发现，Na?能够桥接两个pS293残基，形成pS293-Na?-pS293三元复合物结构，这种桥接作用在二聚体中尤为明显。相比之下，钾离子（K?）虽然与pS293残基存在一定的相互作用，但其作用强度远不及Na?，且无法形成稳定的桥接结构。这一现象可能与Na?和K?的物理化学性质有关，例如Na?具有更高的水合自由能、更小的离子半径以及更慢的扩散速率，这些特性使其更倾向于与磷酸基团结合。此外，我们还发现，当使用K?替代Na?时，pS293R2二聚体的结构特征仍然保持，但其寡聚化能力并未显著增强，这进一步表明Na?在促进pS293R2寡聚化中的关键作用。

为了更全面地理解磷酸化对R2肽寡聚化的影响，我们还对不同体系下的结构特征进行了聚类分析，以识别具有代表性的构象。通过分析MD模拟过程中采样的结构，我们确定了10种最具代表性的构象，这些构象反映了R2肽在不同磷酸化状态下的结构变化。这些结构不仅有助于揭示寡聚化过程中的关键构象转变，还可能为开发针对tau寡聚化的抑制剂提供潜在的靶点。

此外，我们还探讨了不同离子环境对磷酸化R2肽寡聚化的影响。研究发现，钠离子在促进寡聚化过程中起到了重要作用，而钾离子的作用则相对有限。这一发现可能对AD的发病机制提供了新的视角，特别是在离子浓度变化与tau异常磷酸化之间的潜在联系。临床研究表明，高盐摄入与认知功能下降和tau磷酸化之间存在相关性，而高钾摄入则可能具有神经保护作用。因此，理解钠和钾在tau异常磷酸化中的作用，对于探索AD的发病机制和开发有效的治疗策略具有重要意义。

在讨论部分，我们进一步分析了S293和S289位点磷酸化对R2肽寡聚化过程的不同影响。虽然两者都促进了寡聚化，但其作用机制存在差异。S289磷酸化主要通过促进有序到无序的构象转变，而S293磷酸化则通过无序到有序的构象转变来增强寡聚化。这种差异可能与磷酸化位点在R2肽中的位置和周围环境有关。例如，S293位于R2肽的C端，而S289位于N端，两者的不同位置可能影响了磷酸化对二级结构的调控方式。此外，我们还发现，S293磷酸化对R2肽的β折叠形成具有更强的促进作用，这可能与其与钠离子形成的桥接结构有关。

总体而言，本研究揭示了S293位点的异常磷酸化在促进tau蛋白寡聚化中的关键作用，并且这一作用可能通过增强分子间和分子内的相互作用以及β折叠结构的形成来实现。同时，我们还发现，钠离子在这一过程中起到了重要的稳定作用，而钾离子则未能形成类似的桥接结构。这些发现不仅加深了我们对tau蛋白异常磷酸化机制的理解，还为开发针对tau寡聚化的新型抑制剂提供了理论依据。然而，由于本研究基于R2肽片段，而非完整的tau蛋白，因此未来的研究需要进一步考虑完整的tau蛋白以及其与其他分子（如RNA、其他翻译后修饰）的相互作用，以更全面地揭示S293磷酸化在AD病理过程中的作用。

在方法部分，我们详细描述了模拟过程和数据分析方法。为了构建初始结构，我们使用了实验测定的R2-微管复合物的结构（PDB代码6CVN）作为模板，并通过Gromos聚类分析生成了不同构象的结构库。随后，我们使用GROMACS 2018软件包进行了分子动力学模拟，采用了Charmm36m力场来描述tau肽的结构，以及TIP3P模型来模拟水分子。此外，我们还使用了Beglow和Roux的参数来描述钾离子和氯离子，以及Noskov和Roux的参数来描述钠离子，以确保模拟结果的准确性。在模拟过程中，我们对压力和温度进行了控制，使用Berendsen耦合方法和Bussi-Donadio-Parrinello速度缩放方法，确保了系统的稳定性。通过使用Leapfrog算法进行动力学积分，我们获得了足够的采样时间，以捕捉R2肽在不同磷酸化状态下的结构变化。

数据分析方面，我们使用了多种方法来评估R2肽的结构特征，包括侧链-侧链接触频率、氢键相互作用、溶剂可及表面积（SASA）、回转半径（Rg）以及二级结构含量。我们通过设定特定的距离阈值来识别侧链-侧链接触和氢键相互作用，并利用STRIDE算法计算二级结构含量。这些方法共同构成了一个全面的结构分析框架，使我们能够深入理解磷酸化对R2肽寡聚化的影响。

综上所述，本研究通过分子动力学模拟方法，系统地分析了S293位点的异常磷酸化对tau蛋白R2结构域寡聚化的影响。研究结果表明，S293磷酸化不仅增强了分子内的相互作用，还促进了β折叠结构的形成，从而推动了R2肽的寡聚化过程。此外，钠离子在这一过程中起到了重要的稳定作用，而钾离子则未能形成类似的桥接结构。这些发现为理解tau蛋白异常磷酸化在AD发病机制中的作用提供了新的视角，并为开发针对tau寡聚化的新型药物提供了理论基础。未来的研究应进一步结合完整的tau蛋白结构和相关生物分子，以更全面地揭示磷酸化在神经退行性疾病中的复杂作用。