在微粒合成过程中人血清白蛋白的结构不稳定性

《ACS Applied Bio Materials》：Structural Instability of Human Serum Albumin during Microparticles Synthesis

人血清白蛋白微球（HSA-MPs）通过共沉淀-交联-溶解法合成，呈现亚微米级花生形结构，机械性能稳定但导致蛋白质二级结构改变（α-螺旋减少，β-折叠增加），显著降低其血红素结合能力，影响药物递送功能。

　　人类血清白蛋白（HSA）是人体血浆中最丰富的蛋白质之一，占总血浆蛋白的大约60%。它在维持胶体渗透压、调节药物的药代动力学和药效学、以及表现出抗氧化和类似酶的特性方面发挥着关键作用。HSA还具有对多种内源性和外源性分子的高亲和力结合能力。结合其优异的溶解性、生物相容性、生物降解性、低毒性和非免疫原性，这些特性使得HSA成为生物医学应用的理想平台，尤其是在药物递送领域。本研究详细探讨了通过共沉淀-交联-溶解（CCD）方法制备的HSA微粒的物理化学特性。所获得的亚微米颗粒呈花生状，具有均匀的形态，并表现出良好的机械性能，包括高刚性和胶体稳定性。然而，我们观察到微粒聚集过程会引发HSA结构的显著变化。值得注意的是，拉曼光谱和傅里叶变换红外（FTIR）光谱显示HSA从α-螺旋结构部分转变为β-折叠结构，这导致了HSA在微粒表面的结合能力下降，如在血红素结合中的表现所示。这种机械完整性与生物活性之间的权衡，对需要保持HSA原生结构相互作用的应用构成了挑战，例如HSA依赖的高效药物结合和控制释放。相反，HSA分子在微粒表面的结合能力下降意味着这些HSA-微粒（HSA-MPs）无法与血浆中的配体（如药物、血红素、细菌毒素）结合，从而防止了这些配体被运输到细胞靶点，确保只有微粒内部的配体被递送。我们的研究结果为设计结合这些微粒结构韧性和恢复功能表面的微系统开辟了新的途径。

HSA的结构复杂，由585个氨基酸组成，其中α-螺旋结构占主导地位。这种结构分为三个域，分别对应于氨基酸序列的1–195（域I）、196–383（域II）和384–585（域III）。每个域又由两个亚域（A和B）通过一个长环连接。亚域A由6个α-螺旋构成，而亚域B由4个α-螺旋构成。这种结构赋予HSA极强的结合能力，使其能够作为脂肪酸（FAs）的主要载体，同时也能结合多种内源性和外源性配体，如血红素、金属离子、激素、核酸和药物，结合位点包括FA1至FA9。HSA在医学上的应用历史悠久，自20世纪40年代以来，它就被用作血液替代品。随着研究的深入，HSA逐渐成为药物递送系统的重要工具，例如作为治疗剂的载体蛋白、诊断标志物（如糖尿病和肾病的检测）以及微粒和纳米颗粒药物递送平台。HSA微粒和纳米颗粒因其小尺寸、可变形状和不同的结合位点而具有独特的性质，它们的外层设计可以保护药物免受酶解和非特异性吸附，从而延长其半衰期和运输效率。此外，HSA微粒具有低毒性和非免疫原性，使其在生物医学领域具有广泛的应用前景。

然而，HSA微粒的制备过程可能会改变其结构，进而影响其结合能力。本研究旨在探讨HSA微粒在CCD合成过程中的稳定性。CCD方法是一种常用的生物聚合物微粒制备技术，通过使用适当的无机化合物诱导沉淀，能够有效包裹蛋白质。CCD合成的HSA微粒呈花生状，具有均匀的亚微米尺寸分布和良好的机械稳定性。这些微粒可以通过沉淀或在共沉淀过程中同时加载疏水性药物，如多柔比星和核黄素。HSA在微粒表面的存在确保了其细胞内化，从而将所携带的配体一同运输到靶点。这是因为HSA能够识别不同细胞类型表面的受体，包括在癌细胞中高表达的SPARC受体。在本研究中，我们观察到HSA微粒的合成过程导致了HSA结构的显著变化，具体表现为β-折叠结构含量增加，而α-螺旋结构含量减少。这种变化导致了HSA分子在微粒表面的结合能力下降，如在血红素结合中的表现所示。因此，HSA微粒的外表面无法结合血浆中的配体，从而防止了这些配体被运输到细胞靶点，确保只有微粒内部的配体被递送。为了恢复微粒表面HSA的结合能力，可能需要在机械稳定的HSA微粒表面覆盖新的蛋白质层。

为了研究HSA微粒的化学和功能特性，我们使用了拉曼和FTIR光谱技术，以识别HSA在CCD合成过程中可能发生的结构变化。这些光谱技术能够探测分子键的振动模式，从而提供关于化学组成和结构构型的信息。拉曼光谱显示，HSA微粒的结构变化主要体现在其α-螺旋结构减少，β-折叠结构增加。这种结构变化与HSA微粒在血浆中的结合能力下降密切相关。为了进一步验证这些结果，我们进行了FTIR光谱分析，发现HSA微粒的β-折叠结构含量显著增加，而α-螺旋结构含量减少，这种变化与拉曼光谱的结果一致。这些结果表明，HSA微粒的结构在CCD合成过程中发生了显著变化，导致其功能特性受到影响。因此，HSA微粒的合成过程可能会降低其结合能力，从而影响其在药物递送中的应用。

此外，我们还通过紫外-可见（UV–vis）光谱分析了HSA和HSA微粒与血红素的结合能力。UV–vis光谱显示，HSA与血红素形成的复合物在404 nm处有一个特征的Soret吸收峰，而HSA微粒与血红素形成的复合物则在393 nm处表现出吸收峰的红移和展宽。这种变化表明，尽管HSA微粒仍能与血红素发生一定程度的相互作用，但这种相互作用缺乏HSA与血红素之间的特异性结合。这种结合能力的下降可能影响HSA微粒在药物递送中的功能，因为HSA的结合位点对于药物的高效结合和释放至关重要。因此，HSA微粒在药物递送中的应用需要进一步优化，以恢复其表面结合能力，同时保持其机械稳定性。

HSA微粒的结构变化不仅影响其功能，还可能对其在生物医学中的应用产生深远影响。在药物递送系统中，HSA微粒的结构和功能特性是决定其有效性和安全性的关键因素。因此，深入研究HSA微粒的结构变化及其对功能的影响，有助于优化其在药物递送中的应用。此外，HSA微粒的机械性能，如高刚性和良好的粘附性，使其在生物医学领域具有广泛应用潜力。这些机械性能不仅确保了微粒的结构稳定性，还为其在药物运输中的应用提供了支持。然而，HSA微粒的结合能力下降可能限制其在某些药物递送中的应用，特别是那些依赖于正确折叠的HSA进行结合的药物。因此，未来的研究需要探索如何在保持HSA微粒机械性能的同时，恢复其结合能力，以实现更高效和更安全的药物递送。此外，HSA微粒的结构变化还可能影响其在其他生物医学应用中的表现，例如作为生物载体或生物传感器。因此，对HSA微粒的结构和功能特性进行系统研究，有助于开发更高效的生物医学应用。