利用双功能分子在蛋白质组范围内发现可降解蛋白质

《ACS Central Science》：Proteome-Wide Discovery of Degradable Proteins Using Bifunctional Molecules

靶向蛋白降解策略AgnoTACs通过化学 proteomics 发现50+功能多样性蛋白的降解机制，揭示连接链结构对选择性的影响及CRBN依赖与非依赖性降解路径共存。

　　在现代生物医学研究中，针对蛋白质的降解技术正在成为一种全新的治疗策略，为解决传统小分子抑制剂难以处理的蛋白质靶点提供了新的可能性。这一技术的核心理念是利用细胞内固有的降解机制，通过设计特定的小分子化合物，引导目标蛋白进入降解途径，从而实现其功能的调控或消除。其中，一种被称为“靶向蛋白降解”（Targeted Protein Degradation, TPD）的方法，尤其是“蛋白降解靶向嵌合体”（Proteolysis-Targeting Chimeras, PROTACs），近年来受到了广泛关注。PROTACs 是一种异双功能分子，其结构通常包含两个关键部分：一个能够与目标蛋白（Protein of Interest, POI）结合的配体（Target Binding Moiety, TBM）和一个能够招募E3泛素连接酶（E3 ligase）的配体（E3 Ligase Binding Moiety, EBM）。通过将POI与E3泛素连接酶拉近，PROTACs 促使目标蛋白被泛素化，并最终通过泛素-蛋白酶体系统被降解。这种策略相较于传统的抑制剂具有更高的选择性和更广泛的靶点适用性，尤其适用于那些缺乏明确功能位点或无法通过小分子抑制剂进行调控的蛋白质。

然而，尽管PROTACs展现出巨大的潜力，其发展仍受到一定的限制。大多数PROTACs依赖于已知的高亲和力小分子抑制剂作为TBM，这意味着它们的应用范围主要局限于那些已有成熟配体的蛋白质靶点。此外，对于那些尚未有明确功能配体的蛋白质，PROTACs的开发往往面临较大的挑战。为了克服这一障碍，研究人员开发了一种新的策略，即“无靶向”（target-agnostic）的蛋白降解分子，被称为“AgnoTACs”。AgnoTACs 的设计突破了传统PROTACs的局限性，通过结合结构多样的小分子配体与CRBN（Cereblon）泛素连接酶配体，使其能够广泛地识别并降解多种蛋白质，包括那些尚未被明确研究的蛋白质。

为了评估AgnoTACs 的广泛适用性，研究人员在人类细胞中进行了全蛋白质组范围的筛选，结果表明，AgnoTACs 能够有效诱导超过50种功能和结构多样的蛋白质的降解。这些蛋白质涵盖了酶类、转录因子、适配蛋白、转运蛋白、调节蛋白以及蛋白复合物等多种类型。值得注意的是，这些蛋白质中大多数并不具备现有的化学探针。这一发现不仅扩展了可被小分子诱导降解的蛋白质范围，也为开发新的小分子降解剂提供了丰富的研究素材。同时，研究还发现，AgnoTACs 诱导的蛋白质降解事件往往通过经典的CRBN-和蛋白酶体依赖的降解途径进行，但也存在一些通过非经典机制实现的降解现象。这表明，AgnoTACs 可能通过多种不同的方式影响蛋白质的稳定性，而不仅仅是依赖于传统的泛素连接酶途径。

为了进一步验证AgnoTACs 的作用机制，研究人员采用了多种实验方法，包括定量蛋白质组学、免疫印迹分析、细胞热力学迁移实验（CETSA）等。这些方法不仅帮助确认了AgnoTACs 诱导的蛋白质降解事件的真实性，还揭示了其在不同细胞类型和不同蛋白质之间的特异性。例如，在针对BRD2的降解研究中，研究人员发现，AgnoTACs 的降解作用依赖于CRBN的参与，而通过使用结构类似但缺乏CRBN结合能力的阴性对照分子，可以进一步确认降解事件是否与AgnoTACs 的双功能特性有关。此外，对于一些可能通过非CRBN依赖机制被降解的蛋白质，如ETS-1和TMEM205，研究人员也进行了深入的机制分析，确认了这些降解事件可能涉及不同的蛋白降解途径。

在AgnoTACs 的设计过程中，研究人员特别关注了连接子（linker）的结构对降解效果的影响。连接子是将TBM与EBM连接起来的关键部分，其长度和化学结构在很大程度上决定了双功能分子的活性和选择性。通过对不同连接子的分析，研究人员发现，不同的连接子可以影响AgnoTACs 对特定蛋白质的降解效率。例如，PEG（聚乙二醇）连接子在某些情况下表现出比其他类型的连接子更优的降解效果，而一些简单的烷基连接子则对特定靶点的降解能力有限。这些发现不仅有助于优化AgnoTACs 的结构设计，还揭示了连接子在靶点发现中的重要作用。

此外，研究人员还注意到，某些AgnoTACs 诱导的蛋白质降解事件可能与细胞毒性相关。例如，AgnoTAC 2a 在处理过程中显著降低了细胞的存活率，并且影响了多个蛋白质的表达水平。通过进一步的实验，研究人员发现，这种细胞毒性可能与AgnoTACs 诱导的某些关键蛋白的降解有关，如MTCH2（线粒体载体同源物2）。MTCH2 是一种参与线粒体功能的重要蛋白，其降解可能导致细胞代谢紊乱或其他生理变化，从而影响细胞存活。因此，研究人员强调，在评估AgnoTACs 的降解效果时，需要综合考虑其对细胞整体的影响，而不仅仅是对特定蛋白的降解作用。

研究还发现，AgnoTACs 在降解某些蛋白质时，其机制可能与传统PROTACs 不同。例如，对于UFD1和NPL4这两种适配蛋白，研究人员通过实验发现，它们的降解可能并非直接由AgnoTACs 引起，而是由于AgnoTACs 与其中一种蛋白结合后，导致整个复合物的不稳定，从而引发另一种蛋白的降解。这种间接的降解机制表明，AgnoTACs 不仅能够直接靶向特定蛋白，还可能通过影响蛋白质相互作用网络，间接影响其他蛋白的稳定性。这一发现为理解AgnoTACs 的复杂作用机制提供了新的视角。

在实际应用中，AgnoTACs 作为一种“发现工具”，其潜力不仅限于实验室研究，还可能在药物开发中发挥重要作用。通过全蛋白质组范围的筛选，研究人员能够识别出一系列可能成为药物靶点的蛋白质，这些蛋白质往往缺乏现有的小分子抑制剂或探针。这种策略的灵活性使得AgnoTACs 成为一种有力的工具，能够为那些传统方法难以处理的蛋白质提供新的研究和干预途径。同时，AgnoTACs 的使用也带来了新的挑战，例如如何确保其在体内具有足够的生物利用度和选择性，以及如何避免其对非目标蛋白的意外影响。

总的来说，AgnoTACs 的开发和应用标志着靶向蛋白降解技术的一个重要进展。通过结合无靶向的化学探针库与定量蛋白质组学技术，研究人员能够系统地探索哪些蛋白质可以通过小分子诱导降解，并进一步揭示其背后的机制。这一策略不仅拓展了TPD的适用范围，还为开发针对更多蛋白质的小分子降解剂提供了新的思路。随着研究的深入，AgnoTACs 有望成为一种重要的化学工具，帮助科学家更全面地理解蛋白质的功能，并为新的治疗策略提供基础。然而，为了实现这一目标，还需要进一步优化AgnoTACs 的结构设计，并通过多种实验方法验证其在不同生物系统中的有效性。未来，随着技术的不断进步，AgnoTACs 可能成为药物开发中的关键组成部分，为解决传统小分子抑制剂难以处理的蛋白质靶点提供新的解决方案。