一种基于小分子药物的Ru(II)多吡啶标记物，用于组织样本的多模式成像

《ACS Central Science》：A Small Molecule Drug-Based Ru(II) Polypyridine Mass-Tag for Multimodal Imaging of Tissue Samples

靶向质谱成像探针开发及其在肿瘤和脑组织中的双模式成像应用。采用小分子药物奥拉帕尼作为结合基团，钌(II)配位聚合物构建光解报告团，实现PARP1的空间定位与多组学分析同步检测，验证了其特异性、保留内源性代谢物及荧光/质谱双模式兼容性。

　　在现代生物医学研究中，理解组织内部生物分子的空间分布及其相互作用对于揭示细胞功能、疾病发展机制以及治疗反应至关重要。传统的生物分子组学方法，如基因组学、转录组学和蛋白质组学，通常是在细胞或组织整体水平上进行分析，因此会损失掉关于组织微环境的详细空间信息。然而，随着技术的进步，质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）作为一种能够保留组织空间结构并实现多组学分析的技术，逐渐受到关注。MSI不仅能够可视化组织中多种内源性分子的分布，还能够在单次测量中提供综合的分子信息。这种技术对于临床研究尤其有价值，因为它可以在不破坏样本的前提下，以不同分辨率对组织进行分析，从而允许后续的组织学检测，如免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）等，这对于珍贵的临床样本具有重要意义。

尽管MSI在代谢组学和脂质组学中的应用已经相当成熟，但其在蛋白质分析中的应用仍面临诸多挑战。其中，主要的障碍包括离子化效率低、组织复杂环境中的信号干扰以及对低丰度目标的检测灵敏度不足。这些问题限制了MSI在蛋白质空间成像中的应用范围。为了克服这些局限性，研究人员开发了多种策略，其中“组织原位质谱标签标记”（On-Tissue Mass-Tag Labeling, OTMT）技术被认为是一个重要的进展。OTMT利用基于亲和力的成像试剂，将可裂解且高度离子化的报告基团（mass-tag, MT）与靶向分子连接，从而实现对特定生物分子的可视化。

目前，大多数MT依赖于抗体作为靶向元素，结合有机分子作为报告基团。然而，抗体的使用存在一些固有的缺点，例如高昂的生产成本、复杂的合成与纯化过程以及严格的储存和操作条件。此外，抗体在多组学成像中的应用受到其特异性与多功能性的限制。因此，研究人员开始探索其他类型的靶向分子，如小分子药物作为结合基团，以提高OTMT的灵活性和适用性。小分子药物，尤其是已知的药理学抑制剂，具有分子量小、结构可调控性强以及易于合成和存储等优势，这使得它们成为一种理想的结合基团选择。此外，利用现有的数百万种已知生物活性的小分子药物库，可以为MT设计提供丰富的资源，从而拓展OTMT的应用范围。

在本研究中，我们首次提出了一种基于小分子药物的MT设计，即PARPi-MT。该MT结合了聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的抑制剂Olaparib作为靶向结合基团，并使用基于Ru(II)的光裂解和发光报告基团。Olaparib是一种已知的PARP1/2抑制剂，能够特异性地结合PARP1和PARP2，其中PARP1被认为是细胞中主要的PARP活性来源。PARP酶在检测DNA损伤和参与其修复过程中发挥关键作用，而在多种癌症类型中，其表达水平较高，进一步与肿瘤恶化、转移和血管生成相关。因此，PARP1的可视化对于研究肿瘤生物学以及评估治疗反应具有重要意义。

PARPi-MT的设计基于Ru(II)的光裂解特性，该特性使其能够在特定波长的光照下释放出报告基团。Ru(II)的多模态成像能力使其不仅适用于质谱成像，还适用于荧光成像。通过在组织切片上进行标记、洗涤以及光裂解后，使用质谱成像和荧光显微镜对释放的报告基团进行检测，可以实现对PARP1的双重成像。实验结果显示，使用PARPi-MT进行的MSI和荧光成像能够清晰地反映出PARP1在组织中的分布模式，并且与传统的IHC结果高度一致。这一结果验证了PARPi-MT在靶向成像中的有效性。

此外，该研究还评估了使用PARPi-MT后对组织内源性代谢物的影响。通过比较标记和未标记组织切片的质谱成像数据，发现某些分子类别的信号强度发生了变化。例如，较小且极性的分子，如氨基酸、核苷酸、有机酸及其衍生物，在洗涤过程中更容易被去除，而较大且疏水的分子，如脂肪酸和脂质，则能够较好地保留。这表明，PARPi-MT不仅能够实现对目标蛋白的成像，还能够在同一测量过程中保留和分析其他重要的生物分子，从而提供更全面的分子信息。这种能力对于多组学研究和疾病相关分子的可视化具有重要意义。

相较于传统的IHC和IF方法，OTMT技术的优势在于其高通量和多模态的特性。传统的IHC和IF方法通常只能提供单一目标分子的空间信息，而OTMT则能够实现对多个分子的同步检测。此外，OTMT不需要破坏组织样本，因此可以用于进一步的分析，如免疫组织化学和荧光成像。相比之下，一些商业化的MALDI-MSI技术需要进行多步骤的处理，包括两次不同的质谱分析，以分别获取脂质组学和蛋白质组学信息。而本研究提出的方法则能够在一次MSI测量中同时获取多种分子信息，从而提高了实验效率和数据的完整性。

在实际应用中，PARPi-MT的使用需要遵循特定的标记和洗涤流程。首先，将PARPi-MT溶液应用于组织切片，使其与靶向蛋白结合。随后，通过洗涤步骤去除未结合的标签，确保检测的特异性。最后，通过光裂解释放报告基团，并使用质谱成像和荧光显微镜进行分析。这种流程不仅适用于PARP1的成像，也适用于其他靶向分子的检测。通过调整报告基团的结构和结合基团的种类，可以进一步拓展OTMT的应用范围，实现对不同蛋白或酶的多靶点成像。

本研究的创新点在于将小分子药物作为结合基团，结合Ru(II)的光裂解和发光特性，设计出一种新型的OTMT。这种方法不仅克服了抗体类MT在合成和储存上的困难，还提供了更高的灵活性和多功能性。同时，Ru(II)的结构特性使其能够与多种不同的配体结合，从而实现对不同分子的检测。此外，Ru(II)的多模态成像能力使其能够在同一组织切片上同时进行质谱和荧光成像，为研究人员提供了更丰富的数据来源。

未来的研究方向将聚焦于优化Ru(II) MT的设计，以提高其光裂解效率和多靶点成像能力。例如，可以进一步探索不同配体的结构对光裂解过程的影响，以及如何通过改变配体的种类和数量来提高检测的灵敏度和特异性。此外，还可以评估不同洗涤方案对组织中内源性分子保留的影响，以确保在标记过程中不会对其他重要分子造成不必要的损失。同时，研究团队也计划开发基于其他酶或蛋白的小分子抑制剂的MT，以扩展OTMT在不同疾病模型中的应用。例如，针对纤维化激活蛋白（FAP）的抑制剂已经被成功应用于放射性药物的设计，这为开发靶向FAP的Ru(II) MT提供了可能性。

综上所述，本研究提出了一种基于小分子药物的新型OTMT，即PARPi-MT。该技术不仅克服了传统抗体类MT的局限性，还拓展了MSI在空间蛋白质组学中的应用潜力。通过结合Ru(II)的光裂解和发光特性，PARPi-MT能够在组织切片上实现对PARP1的双重成像，并且在不影响组织完整性的情况下保留了内源性代谢物的信息。这种多模态和多靶点的成像能力为临床研究和疾病机制探索提供了新的工具和方法，有助于更深入地理解生物分子在组织中的分布及其功能。未来，随着技术的进一步发展和优化，基于小分子药物的OTMT有望成为空间多组学研究的重要手段，推动精准医学和生物医学成像技术的进步。