一种新的分段梯度高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）结合光谱指数图方法，用于测定黑咖啡和绿咖啡中的咖啡因和绿原酸含量

《ACS Omega》：A New Segmented Gradient HPLC-DAD and Spectra Index Plots for Measuring Caffeine and Chlorogenic Acid in Dark and Green Coffees

咖啡因（CAFF）和绿原酸（ChGA）在传统埃及咖啡制作中的含量差异及高效液相色谱法研究。采用分段梯度洗脱高效液相色谱-二极管阵列检测器（SGE-HPLC-DAD）法，优化色谱柱（Luna Cyano）和流动相（水/乙腈），在11分钟内实现CAFF（0.4-1000 μg/mL）和ChGA（0.6-1000 μg/mL）的高灵敏度定量分析。比较发现玻璃锅具烹饪的深色咖啡（DC）和绿色咖啡（GC）中CAFF含量分别提高2.0%和1.5%，而ChGA在GC中高达4.0%，显著高于DC（<0.5%）。方法验证显示R2>0.99，回收率100.1%-101.3%，表明该方法快速（11min）、灵敏（LOD 0.1-0.16 μg/mL）、适合工业化质量控制。

　　咖啡作为一种深受全球消费者喜爱的饮品，不仅因其独特的风味而闻名，还因其在历史、文化、社会和经济层面的重要意义而备受关注。咖啡植物属于茜草科（Rubiaceae）的咖啡属（Coffea），其中常见的品种包括阿拉比卡（Coffea arabica）和罗布斯塔（Coffea robusta）。阿拉比卡主要产自南美洲（尤其是巴西）以及东非的高地和山区，而罗布斯塔则多分布在中非和西非的低地地区，以及南亚的部分区域，例如越南。咖啡的品质主要取决于其烘焙后的化学组成，这些组成又受到生豆的特性及采摘后加工条件的影响。因此，研究咖啡中生物活性成分的含量及其变化对于理解其生理和药理作用具有重要意义。

咖啡中富含多种生物活性物质，其中两种重要的成分是绿原酸（Chlorogenic Acid, ChGA）和咖啡因（Caffeine, CAFF）。绿原酸是一种由奎宁酸和咖啡酸通过酯化反应形成的化合物，通常被归类为植物的次生代谢产物，其作用在于帮助植物抵御环境压力。此外，绿原酸具有抗氧化特性，有助于保护食物、细胞和器官免受氧化损伤，并可能带来一定的健康益处，例如有助于调节血压和血糖水平。咖啡因则是一种嘌呤类生物碱，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，其来源于甲基黄嘌呤这一基本结构。咖啡因赋予咖啡独特的苦味，并可用于评估其品质。同时，它作为中枢神经系统的刺激剂，能够帮助人们保持清醒、减少疲劳并提升能量水平。然而，过量摄入咖啡因可能导致不适症状，如兴奋和焦虑，因此建议的每日咖啡摄入量需根据个人健康状况进行调整。一杯咖啡中的咖啡因含量通常在95至330毫克之间，尽管其在溶液中相对稳定，但其浓度可能因烘焙程度的不同而有所变化。

由于咖啡中各种植物化学成分的组成和浓度存在显著差异，因此需要对其进行全面分析，以准确评估其对健康的影响。本研究中，我们专注于开发一种快速且高灵敏度的分段梯度洗脱高效液相色谱法（Segmented Gradient Elution High-Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector, SGE-HPLC-DAD）来测定咖啡样品中的绿原酸和咖啡因含量。该方法使用了Luna氰基柱（5 μm，25 × 0.46 cm），并结合了溶剂A（1%三氟乙酸的水溶液）和溶剂B（乙腈）的梯度洗脱程序。洗脱过程分为几个阶段：前4分钟，溶剂B的浓度从5%逐渐增加到8%；接下来的1分钟，溶剂B的浓度迅速提升至100%；随后的5至7分钟保持100%溶剂B的等度洗脱；7至8分钟期间，溶剂B的浓度从100%线性下降至5%；最后，溶剂A和B的混合比例为95:5（体积比），持续至11分钟。整个过程的流速保持在1.5 mL/min，检测波长为254 nm。该方法在分离和定量咖啡因和绿原酸方面表现出良好的线性关系，且具有较高的回收率和重复性，适用于实际样品的分析。

在实验过程中，我们选择了两种常见的咖啡样品——绿咖啡（GC）和黑咖啡（DC），并模拟了埃及传统咖啡制作方式，以评估不同材质的烹饪器具对咖啡中生物活性成分的影响。通过使用玻璃和不锈钢两种材质的烹饪器具，我们对咖啡的制作过程进行了重复三次，并对所得样品进行了处理和分析。具体而言，绿咖啡和黑咖啡分别在玻璃和不锈钢器具中进行加热，随后取样并进行2倍稀释，最终通过0.22 μm滤膜过滤后，使用SGE-HPLC-DAD方法进行分析。分析结果显示，咖啡因和绿原酸的含量在不同烹饪条件下存在显著差异，且这些差异可能与咖啡的风味和口感有关。

本研究中，我们对SGE-HPLC-DAD方法进行了全面的验证，包括线性关系、检测限和定量限、重复性、选择性和稳健性等方面。通过绘制咖啡因和绿原酸的标准曲线，我们发现其峰面积与浓度之间存在良好的线性关系，相关系数（R2）分别达到0.9996和0.9991，表明该方法在测定这两种成分时具有较高的准确性。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.10 μg/mL和0.35 μg/mL（咖啡因），以及0.16 μg/mL和0.53 μg/mL（绿原酸），说明该方法能够检测到极低浓度的这两种成分。此外，通过计算实验的重复性和跨日重复性，我们发现咖啡因和绿原酸的回收率分别为100.97%和101.33%，相对标准偏差（RSD）均低于1%，进一步证明了该方法的高重复性和可靠性。选择性测试表明，SGE-HPLC-DAD方法能够有效分离咖啡因和绿原酸，即使在复杂的咖啡基质中也能避免其他成分的干扰。稳健性测试则显示，即使在流速和洗脱系统组成发生微小变化的情况下，该方法仍能保持较高的稳定性，从而适用于实际的质量控制工作。

在实际应用方面，SGE-HPLC-DAD方法在测定咖啡因和绿原酸时表现出优于传统HPLC方法的特性。传统的HPLC方法通常需要较长的分析时间（35至95分钟），而SGE-HPLC-DAD方法仅需11分钟即可完成，这大大提高了分析效率。同时，该方法在灵敏度方面也表现出色，尤其是在使用二极管阵列检测器（DAD）时，能够提供更丰富的光谱信息，有助于化合物的准确识别。此外，SGE-HPLC-DAD方法在减少基质效应和缩短分析时间方面也显示出优势，使其成为一种简单、高效且经济的分析工具。

在对不同烹饪材料对咖啡因和绿原酸含量的影响进行分析时，我们发现玻璃和不锈钢两种材质对咖啡成分的保留和释放存在差异。具体而言，使用玻璃器具制作的黑咖啡和绿咖啡中，咖啡因的含量略微高于使用不锈钢器具制作的样品，这种差异可能与玻璃器具的导热性和对咖啡成分的吸附特性有关。然而，这种差异相对较小，仅为2%左右。相比之下，绿原酸的含量则在玻璃器具中表现出更显著的提升，特别是在绿咖啡中，玻璃器具的使用使绿原酸的含量超过4.00%，而使用不锈钢器具时则低于3.50%。这一结果表明，烹饪材料的选择对绿原酸的保留和释放具有重要影响，而这种影响可能与玻璃器具的非极性特性有关，使其能够更有效地保留某些化合物。

此外，黑咖啡的绿原酸含量普遍低于绿咖啡，这可能与烘焙过程中的化学变化有关。烘焙过程中，绿原酸会部分分解，导致其含量降低。而绿咖啡由于未经过烘焙，其绿原酸含量较高。因此，咖啡的种类和制作方式对生物活性成分的含量具有显著影响。值得注意的是，尽管咖啡因和绿原酸在咖啡中具有一定的健康益处，但在实际应用中，咖啡的风味往往是消费者选择的重要因素，甚至可能掩盖其潜在的健康价值。

本研究的结论表明，SGE-HPLC-DAD方法在咖啡中咖啡因和绿原酸的测定中具有显著优势，包括分析速度、灵敏度和准确性等方面。该方法的建立不仅为咖啡的质量控制提供了有效的工具，也为进一步研究咖啡的化学组成及其对健康的影响奠定了基础。同时，研究结果也揭示了烹饪材料对咖啡成分的影响，这为优化咖啡制作工艺、提高其营养价值提供了新的思路。然而，尽管这些成分对健康有益，但咖啡的风味仍然是消费者在选择制作方式时的首要考虑因素。因此，在实际应用中，如何在保持咖啡风味的同时提高其生物活性成分的含量，仍然是一个值得深入研究的问题。