长距离高pH质子通道促进了含铜亚硝酸盐还原酶中的亚硝酸盐还原反应

《ACS Omega》：The Long-Range High-pH Proton Channel Facilitates the Nitrite Reduction in Copper-Containing Nitrite Reductase

催化硝酸盐还原的铜含氮还原酶（CuNiR）通过高pH质子通道完成第二质子化步骤，该步骤能量势垒最低（20.0 kcal/mol），成为整体速率决定步骤，主通道对应步骤势垒高达32.6 kcal/mol。研究揭示了水介导的质子传递与电子转移协同机制，深化了生物脱氮过程的理论认知。

　　铜含有硝酸盐还原酶（CuNiR）是生物脱氮过程中的关键酶之一，其主要功能是催化硝酸盐（NO??）转化为一氧化氮（NO）。这一反应过程对于维持生态系统的氮循环至关重要，尤其是在减少环境中的氮污染方面。然而，CuNiR催化的硝酸盐还原过程中，第二个质子化步骤的质子转移（PT）和电子转移（ET）机制仍然存在许多未解之谜。本研究通过采用双层量子力学/分子力学（QM1/QM2）方法，系统地分析了该酶在两个远程质子通道中的PT与ET机制，揭示了其在生物脱氮中的核心作用。

### 氮循环与CuNiR的生物学意义

氮循环是自然界中维持无机氮和有机氮平衡的重要过程，包括固氮和脱氮两个主要环节。固氮微生物能够将大气中的氮气转化为可被生物利用的氮化合物，而脱氮则是通过微生物的无氧呼吸将生物体内的氮氧化物重新释放到大气中。随着人类活动的增加，特别是哈伯-博世工艺的发明，人类对氮循环的干预导致了生态系统的氮平衡被打破，从而引发了诸如富营养化和藻类爆发等环境问题。目前，脱氮是唯一被证实可以将硝酸盐转化为气态氮气（N?）的生物过程。因此，深入理解生物脱氮的详细机制，有助于控制和缓解人类活动对生态环境的影响。

在这一过程中，CuNiR催化硝酸盐转化为一氧化氮是脱氮的第二步。根据其紫外-可见光谱特征和与外源电子供体蛋白的相互作用，CuNiR可以分为绿色和蓝色两种亚型。绿色CuNiR通常与伪青霉素蛋白结合，而蓝色CuNiR则与青霉素或细胞色素c相互作用。尽管两种亚型在结构上有所不同，但它们都具有同源三聚体的构型，每个单体包含一个类型一铜（T1Cu）中心和一个类型二铜（T2Cu）位点。T1Cu中心由两个组氨酸（His）残基、一个半胱氨酸（Cys）和一个甲硫氨酸（Met）配位，负责将电子从外源供体蛋白传递到T2Cu位点。T2Cu位点则是催化硝酸盐还原的核心，其配位结构由三个组氨酸残基和一个水分子（H?O）组成。每个催化循环需要消耗一个电子和两个质子，反应通常从硝酸盐分子取代T2Cu位点的水分子并配位开始。

### CuNiR催化机制的争议与进展

关于CuNiR催化机制的顺序，尤其是电子转移（ET）和质子转移（PT）的顺序，科学界一直存在不同的观点。一些实验和理论研究认为，ET发生在硝酸盐配位之前，而另一些则认为PT和ET的顺序依赖于局部浓度和pH值。Ghosh及其团队构建了二维反应坐标图，揭示了在CuNiR催化过程中，硝酸盐分解为NO的反应自发发生，伴随着从T2Cu?到硝酸（HNO?）的ET。这些结果表明，T2Cu介导的硝酸盐分解可以在不依赖于二次质子化的情况下进行。我们的前期研究进一步表明，硝酸盐的第一次质子化生成T2Cu?-HNO?中间体，随后需要更多的质子进入活性位点才能完成NO的形成。然而，第一次质子化在底物结合位点引起的立体和电子阻碍，可能会限制后续质子进入活性位点的通道。

最近的理论研究指出，HNO?与氧化态T2Cu2?形成稳定的配位复合物，从而触发HO–ON键的自发断裂，生成NO?和T2Cu2?–OH?。Maekawa等人则通过有机金属T2Cu模型复合物，系统地绘制了HNO?在CuNiR中的pH依赖反应路径。研究结果表明，在中性条件下，HNO?的还原是一个次要路径，而在酸性条件下则成为主导路径。尽管底物的第一次质子化可能对第二次质子化产生阻碍，但关于第二次质子化过程中的远程PT和ET机制，仍然存在许多未解之谜，需要进一步的实验和计算研究来阐明。

### 两个远程质子通道的结构与功能

已有研究表明，CuNiR中存在两条远程质子通道，分别称为高pH质子通道和主质子通道。这两条通道在绿色CuNiR（如Alcaligenes faecalis的AfNiR和Achromobacter cycloclastes的AcNiR）以及蓝色CuNiR（如Alcaligenes xylosoxidans的AxNiR）中均表现出高度的结构保守性。结构分析显示，高pH质子通道起始于Asp98，通过Ans96（AxNiR中的Asn90）、Gly109（AxNiR中的Gly103）和Ala137（AxNiR中的Ala131），经过三个水分子后到达入口守门残基（如AfNiR中的Glu113、AcNiR中的Gln113或AxNiR中的Ans107）。在AfNiR和AcNiR中，Ans96、Gly109和Ala137对高pH质子通道的稳定性起着关键作用。

主质子通道则从T2Cu位点延伸到表面暴露的Lys128（AxNiR中的Arg122），通过Asp98–His255–His260和一个界面水网络进行。His260（AxNiR中的His254）位于通道的中间，调节质子的流动。N90S替换实验表明，该替换会降低酶的活性约70%，确认了高pH通道在硝酸盐还原中的主导作用。相比之下，His254的F突变对催化过程影响较小，说明该通道具有功能冗余性。前期计算研究已经指出，主质子通道在第一次硝酸盐质子化中具有较低的能量壁垒（6.7 kcal/mol），但关于第二次硝酸盐质子化的主导通道，目前仍未明确。

### 第二次硝酸盐质子化过程中的PT与ET机制

为了揭示CuNiR催化过程中第二次硝酸盐质子化的PT与ET机制，我们采用双层QM1/QM2方法，对两条远程质子通道中的PT和ET过程进行了详细分析。研究结果表明，在高pH质子通道中，Glu113启动了一个水介导的三步PT，从Glu113到WS3，随后直接PT到Asp98，并通过质子耦合的β-ET将电子从T2Cu传递到NO。而在主质子通道中，Lys128驱动的三步PT通过Wp1和Wp2传递到His260，然后通过水介导的两步PT从His260到His255，最终通过质子耦合的β-ET从His255传递到HNO?。

能量分析表明，第二次硝酸盐质子化是整个催化反应中的速率限制步骤，而高pH通道在CuNiR催化中具有更高的能量优势。这表明，尽管主质子通道在第一次质子化中表现出更高的效率，但高pH通道在第二次质子化中更为关键。研究还发现，高pH通道中从Glu113到WS3的PT过程具有最高的能量壁垒（20.0 kcal/mol），而主质子通道中从His255到HNO?的PT过程则具有较高的能量壁垒（32.6 kcal/mol），这表明高pH通道在CuNiR催化中更为关键。因此，综合考虑整个硝酸盐还原反应中的PT和ET过程，高pH通道可能是CuNiR催化硝酸盐还原的更优路径。

### 质子通道的结构与功能冗余性

进一步研究显示，两条质子通道在结构和功能上存在显著差异。高pH通道通过一系列水分子连接Glu113和WS3，随后直接将质子传递到Asp98，再通过质子耦合的β-ET传递到HNO?。主质子通道则通过Wp1和Wp2将质子从Lys128传递到His260，再通过Wp3和Wp4传递到His255，最终通过质子耦合的β-ET传递到HNO?。这两种不同的PT路径在能量壁垒上表现出明显差异，其中高pH通道的PT过程具有更低的能量壁垒（20.0 kcal/mol），而主质子通道的PT过程则具有更高的能量壁垒（32.6 kcal/mol）。这一结果表明，高pH通道在CuNiR催化中更为关键。

此外，一些研究还指出，主质子通道中的某些氨基酸残基（如His255）在调节PT和ET过程中起着重要作用。这些残基通过与水分子形成氢键网络，稳定了整个质子传递路径。而高pH通道中的某些残基（如Asp98）则通过与水分子形成氢键，进一步促进了质子的传递。因此，这些残基在CuNiR催化过程中具有重要的结构和功能意义。为了进一步验证这些假设，需要进行更多的突变实验，以评估这些质子通道的可靠性，并实现对硝酸盐还原机制的全面理解。

### 计算方法与模型构建

本研究基于绿色CuNiR的X射线结构（PDB代码：1AS6），构建了一系列计算模型，用于分析高pH通道和主质子通道中的PT与ET机制。为了在准确性和计算效率之间取得平衡，我们采用了双层QM1/QM2方法。这些模型包括T1Cu中心和T2Cu位点，其中T1Cu中心由His95、His145、Met150、Cys136配位，而T2Cu位点则由His100、His135、His306和HNO?配位。此外，T1Cu和T2Cu之间通过一个约12.5 ?的Cys–His桥连接，该桥被认为是潜在的ET路径。

为了更精确地模拟PT过程，我们构建了详细的计算模型，包括高pH通道中的Glu113、His255、Asp98以及主质子通道中的Lys128、His260、His255等关键残基。通过这些模型，我们能够清晰地观察到质子的传递路径和电子的转移过程。此外，为了更全面地理解整个催化反应，我们还对不同的溶剂环境进行了单点计算，包括水、二氯乙烷和二乙醚，以评估不同条件下的PT和ET行为。

### 结论与未来展望

本研究的理论分析表明，硝酸盐的第二次质子化过程通过高pH通道和主质子通道的远程PT和ET机制进行。高pH通道中的PT过程涉及从Glu113到WS3的水介导三步PT，随后直接PT到Asp98，并通过质子耦合的β-ET将电子从T2Cu传递到NO。主质子通道中的PT过程则涉及从Lys128到His260的水介导三步PT，再通过水介导的两步PT从His260到His255，最终通过质子耦合的β-ET将电子从His255传递到HNO?。能量分析表明，第二次质子化是整个催化反应中的速率限制步骤，而高pH通道在CuNiR催化中提供了更具优势的质子传递路径。

本研究不仅揭示了CuNiR在硝酸盐还原中的详细机制，还为生物脱氮过程提供了新的理论依据。通过这些研究，我们能够更好地理解硝酸盐还原的生物化学过程，并为未来的定向突变实验提供有价值的指导。此外，由于计算模型在解释PT和ET机制方面可能存在一定的局限性，因此对完整蛋白质系统的QM/MM研究仍然是揭示CuNiR催化机制的重要方向。进一步的研究将聚焦于pH和离子强度对CuNiR催化过程中PT和ET机制的影响，以验证我们的假设并深化对生物脱氮的理解。